Participación de Limk1 en la regulación de la dinámica del Aparato de Golgi, el tráfico de vesículas y la extensión neurítica en neuronas de hipocampo

PERETTI D; ROSSO S; BOLLATI F; QUIROGA S; CACERES A

Vaquerias

Taller; V Taller de Neurociencias.; 2003

 En el establecimiento de la polaridad neuronal, la dinámica del citoesqueleto de actina cumple un rol crucial, en el cual intervienen proteínas de la familia de las Rho-GTPasas, tales como Rho, Rac, Cdc42 y sus proteínasefectoras destacándose ADF- Cofilina, cuya actividad depolimerizante de F-actina es inhibida por una familia dequinasas, recientemente descripta, designada como LIMKs. Uno de sus miembros es la proteína LIMK1, la cual está altamente expresada en sistema nervioso. Evidencias previas muestran que LIMK1 es crítica en la regulación de la dinámica de actina. En base a lo anteriormente expuesto, nos propusimos estudiar el rol de LIMK1 durante el desarrollo neuronal, para ello analizamos en primera instancia, el curso temporal de expresión en homogenatos totales de corteza de rata. LIMK1 comienza a expresarse en la etapa terminal de diferenciación neuronal (E18), mostrando los más altos niveles hacia el final de la primera semana postnatal, declinando en la adultez. Mediante técnicas bioquímicas y de microscopía de fluorescencia estudiamos la distribución subcelular de LIMK1, la cual presenta un enriquecimiento en membranas del aparato de Golgi (AG), donde coinmunoprecipita con PAK y Cdk5, y en conos de crecimiento(CC). Esta proteína está compuesta por dos dominios LIM, un dominio PDZ y uno PK, responsable de su actividad catalítica. Nuestros resultados sugieren que los dominios LIM son necesarios para la localización en AG, mientras que el dominio PDZ es necesario para la localización en CC y su exclusión del núcleo celular. Video microscopía de neuronas co-transfectadas con GALT2-YFP (enzima residente de TGN del AG) y LIMK1wt o LIMK1kd (con mutación puntual para anulación de la actividad quinasa) revelan que LIMK1wt suprime la actividad dinámica del AG, por el contrario LIMK1kd tiende a aumentar esta actividad. Para evaluar la posible participación de LIMK1 en la regulación del tráfico vesicular proveniente del AG, se realizaron co-transfecciones de LIMK1wt o LIMK1kd con GFP-Sinaptofisina. En las células transfectadas con LIMK1wt y GFP-Sinaptofisina, se observa una inhibición de la salida de vesículas y el efecto inverso con la sobre-expresión de LIMK1kd. Además, la sobre-expresión de LIMK1wt aumenta selectivamente los niveles de cofilina fosforilada, tanto en AG como en CC y, por el contrario, la sobre-expresión de LIMK1kd los reduce de forma dramática. Paralelamente los niveles de F-actina en neuronas cultivadas muestran un incremento en AG y en los extremos
neuríticos en presencia de LIMK1wt y una evidente reducción con LIMK1kd. Por último evaluamos los efectos de la sobre-expresión de LIMK1 sobre la morfología neuronal a diferentes
tiempos post-transfección. La células transfectadas con LIMK1wt a las 12-15 hs muestran un alto grado de diferenciación morfológica, con neuritas largas y un proceso axonal mayor a 400µm con múltiples ramificaciones colaterales y CC grandes con abundante F-actina presentando a su vez estructuras similares a CC en lugares ectópicos. A las 24-30 hs post-transfección se produce una significativa reducción en el número de ramificaciones colaterales, retracción de los conos de crecimiento y de los procesos incluido el axón. Las neuronas transfectadas con LIMK1kd a diferentes tiempos post-transfección muestran una morfología general similar a las neuronas controles pero con un axón  mas largo y conos de crecimiento pequeños con suave tinción para faloidina rodamina. Los resultados muestran claramente que LIMK1 participa en forma activa en la morfogénesis neuronal. Es importante destacar esta nueva localización subcelular en AG, en el cual LIMK1 regula la dinámica y el tráfico vesicular.