REGULACIÓN CIRCADIANA DE LA BIOSÍNTESIS DE FOSFOLÍPIDOS EN CÉLULAS EN CULTIVO Y PARTICIPACIÓN DE PROTEÍNAS RELOJ. MARIO E. GUIDO. CIQUIBIC-Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, CONICET, Córdoba.
En los vertebrados, el sistema circadiano que controla temporalmente la fisiología del organismo está constituido por la retina, relojes centrales, y un número indeterminado de osciladores ubicados en órganos periféricos. Utilizando cultivos de fibroblastos NIH 3T3 como modelo de osciladores periféricos, hemos caracterizado la capacidad de estas células en generar variaciones diarias en los niveles de síntesis de fosfolípidos. Fibroblastos en estado quiescente fueron mantenidos en cultivo por varios dias y sincronizados mediante tratamiento con suero fetal concentrado por 2 h. Las células exhibieron un ritmo endógeno de marcación de fosfolípidos con ditintos precursores (32P o 3H-glicerol) con un período circadiano de ~ 29 h que perdura al menos por 2 ciclos. Fosfatidilinositol (PI) y fosfatidilcolina (PC) fueron los fosfolípidos mayoritariamente marcados con 32P y 3H-glicerol respectivamente, a los tiempos estudiados. Asimismo, el RNA y la proteina el gen reloj Period 1, involucrado en los mecanismos oscilatorios intrínsecos, presentó una variación circadiana en antifase a la oscilación metabólica observada, que cuando se bloqueó mediante el uso de ?antisense? ó se usaron fibroblastos CLOCK (mutante con los mecanismos oscilatorios totalmente alterados), se perdió dicha ritmicidad metabólica. Dado que PC es uno de los lípidos mas abundantes, cuyos niveles cambian significativamente a lo largo del día, se investigó la expresión y actividad de CTP:fosfocolina citidil transferasa (CT), enzima limitante en su biosíntesis. Se encontró que la actividad CT presenta cambios diarios significativos en los cultivos con un periodo ~ 29 h, mientras que los niveles de proteína para las distintas isoformas investigadas (CTa y CTb) muestran diferente distribución subcelular y expresión temporal. Por otra parte, células ganglionares de la retina de pollo, que juegan un rol esencial en el sistema circadiano, también exhiben variaciones diarias en el metabolismo de sus fosfolípidos in vivo en condiciones de oscuridad o luz constante, y en cultivo después de su inmunopurificación. Los mayores niveles de marcación se observaron en las horas finales de la noche y durante el día subjetivo, mientras que en cultivo, estas células exhibieron un ritmo diario de marcación de ~ 24 h. Cambios similares se observaron en la actividad in vitro de las enzimas lisofosfolípido:acil transferasa II y fosfatidato fosfohidrolasa, lo que permitiría inferir que un proceso coordinado temporalmente tiene lugar en estas células para la biosíntesis lipídica. En conclusión, la regulación temporal de la biosíntesis de fosfolípidos responde a un fenómeno generalizado presente tanto en células de mamíferos como de aves, y que se genera a través de la actividad celular intrínseca.
