Erysiphe cichoracearum es un hongo ascomicete, biótrofo obligado, que ataca unas 300 especies vegetales incluyendo cucurbitáceas (pepino de invernadero, melón y zapallo), plantas ornamentales, papa, lechuga, vid, entre otras. Este mildiu pulverulento afecta hojas, brotes, tallo, flores y frutos generando importantes pérdidas en cultivos. Aunque para algunas especies particulares (cucurbitáceas, lechuga, otras) existen variedades resistentes al hongo, la enfermedad es controlada en muchos casos con fungicidas y prácticas de biocontrol. Nuestros estudios pretenden caracterizar nuevos rasgos moleculares y fisiológicos de la interacción de este patógeno con el hospedante Arabidopsis thaliana para identificar genes vegetales específicamente alterados en procesos de enfermedad. Tales genes podrían resultar útiles para desarrollar herramientas biotecnológicas dirigidas al control de infecciones causadas por E. cichoracearum.
En contacto con tejido foliar de plantas susceptibles de A. thaliana las conidias de E. cichoracearum germinan y diferencian una serie de estructuras infectivas especializadas culminando con la generación masiva de nuevas conidias en el término de 5-7 días. El grado de desarrollo del hongo sobre los distintos genotipos de esta planta es variable y depende de dos tipos de efectos contrapuestos que ejerce el vegetal: la activación de defensas que contrarrestan su desarrollo pudiendo provocar su muerte y la existencia de factores de susceptibilidad que promueven su virulencia. El segundo de estos aspectos se analiza en el presente trabajo.
Utilizando una única cepa virulenta de E. cichoracearum y tres ecotipos de A. thaliana con distinto grado de susceptibilidad al patógeno (ecotipos Kas-1, Col-0 y Te-0), monitoreamos el desarrollo del proceso infectivo en estas tres plantas. Se ha descripto que plantas Kas-1 establecen una interacción incompatible con el hongo y activan una resistencia de tipo ?gen a gen? provocando respuestas de muerte. Por el contrario, plantas Col-0 sostienen una interacción compatible con el patógeno favoreciendo su proliferación. Finalmente, plantas Te-0 exhiben una resistencia parcial a la infección, siendo esta respuesta de carácter poligénico y no asociada la muerte.
Por ensayos fisiológicos determinamos que en plantas Te-0 el hongo no completa su ciclo infectivo aunque es capaz de desarrollar haustorios funcional y estructuralmente normales. Observamos además que estas plantas no activan en los tejidos infectados respuestas netas de defensa (estrés oxidativo, deposición de calosa, muerte celular). Estos datos, junto al carácter poligénico de la resistencia de Te-0, son compatibles con la ausencia de factores de susceptibilidad a E. cichoracearum en plantas Te-0, los cuales estarían presentes en plantas Col-0. Este trabajo se dirige a identificar genes que podrían afectar la generación de tales factores de susceptibilidad (genes marcadores de susceptibilidad).
Cuantificando cada una de estructuras fúngicas desarrolladas en plantas Kas-1, Col-0 y Te-0 identificamos etapas del desarrollo fúngico que serían limitantes para su proliferación en plantas Te-0. A continuación analizamos la expresión génica del hospedante en tales etapas. Mediante la construcción de librerías de hibridización substractiva de cDNAs, seleccionamos genes de A. thaliana cuya expresión es diferencial (inducida/reprimida) en plantas Col-0 pero no en Te-0, previendo que en este grupo se encuentren genes marcadores de susceptibilidad. Sin embargo, dado que cualquier condición de infección también activa a genes de defensa, estos últimos podrían formar parte del grupo de genes seleccionados.
Con el objeto de descartar de este análisis a los genes de defensa y considerando que los mismos no han sido caracterizados para la interacción de A. thaliana con E. cichoracearum, nos propusimos identificarlos. Para este fin desarrollamos experimentos de microarreglos donde analizamos la expresión de ¼ de los genes de A. thaliana en una etapa limitante de la infección con E. cichoracearum. El experimento se realizó utilizando 4 réplicas biológicas y analizando ~11.500 ESTs (microarreglos de cDNA del Arabidopsis Functional Genomics Consortium). Los microarreglos se hibridizaron con sondas que permitieron comparar el transcriptoma de tres tipos de plantas susceptibles al hongo en una etapa limitante de la infección: plantas salvajes npr1 y jar1. Las dos últimas son mutantes deficientes en vías de señalización de defensas mediadas por SA (npr1) ó por JA (jar1), las cuales constituyen las vías más relevantes de la defensa biótica. De este modo el ensayo nos permitió caracterizar la contribución del SA y el JA en la señalización de defensas inducidas por E. cichoracearum e identificar a los genes de defensa alterados en tal infección (comparación Col-0 vs npr1 ó jar1). Tales genes fueron descartados del análisis permitiéndonos seleccionar a aquellos inducidos/reprimidos sólo en plantas susceptibles en etapas tempranas de la enfermedad.
Los resultados de los experimentos descriptos permitieron en su conjunto seleccionar ~70 genes de A. thaliana que alteran significativamente su nivel de expresión (2 veces) en condiciones de susceptibilidad y no están asociados a la inducción de defensas. El comportamiento predicho por los experimentos de hibridización substractiva y microarreglos fue corroborado para una decena de estos genes a través de ensayos de Northern blot, donde evaluamos la abundancia de transcriptos en tejidos infectados de plantas Col-0, Te-0 y Kas-0 y seleccionamos genes cuyo nivel de inducción/represión se correlaciona en forma directa con el nivel de susceptibilidad a la infección. La función de este subgrupo de genes y su efecto sobre el desarrollo de enfermedad ó resistencia será analizada en plantas transgénicas que expresen niveles alterados de los mismos.
Así, estos estudios contribuyen a definir la identidad de genes vegetales diferencialmente expresados en etapas tempranas de la enfermedad causada por E. cichoracearum. El silenciamiento de tales genes, que podrían codificar a factores de susceptibilidad, podría ser utilizado para generar nuevas estrategias de control de enfermedades fúngicas.
