La preparación de electrodos de superficie nanoestructurada para el diseño de (bio)sensores electroquímicos ha suscitado un gran interés en los últimos años. Estos electrodos poseen propiedades ventajosas derivadas de las características únicas de los nanomateriales utilizados como modificadores. Por ejemplo, los nanotubos de carbono (CNTs) provocan un efecto electrocatalítico intenso hacia los procesos redox de varias moléculas y un aumento en la sensibilidad para su detección. Las últimas tendencias en esta área van encaminadas a la preparación de híbridos de nanotubos de carbono y otros materiales. Los electrodos modificados con híbridos de nanotubos de carbono y polímeros conductores electrónicos poseen propiedades catalíticas y conductoras mejoradas respecto de las de ambos componentes por separado debido al efecto sinérgico que se produce en la mezcla.
El poli(3-metiltiofeno) (P3MT) es un polímero conductor electrónico utilizado como modificador para minimizar el ensuciamiento electródico superficial. Recientemente, en nuestro Grupo de Investigación se ha sintetizado un material híbrido de P3MT y MWCNTs sobre la superficie de un electrodo de carbono vitrificado (GCE), que mostraba excelentes respuestas electroquímicas, con intensa actividad electrocatalítica, para la determinación de NADH, observándose también la existencia transferencia electrónica directa del citocromo c y el FAD con la superficie modificada1.
En este trabajo se describe la inmovilización del citocromo c (Cyt c) sobre la superficie del electrodo P3MT-MWCNTs-GCE. El biosensor resultante proporciona excelentes respuestas electroanalíticas para el proceso de reducción del H2O2. Para llevar a cabo la inmovilización, se incuba el electrodo híbrido en una disolución acuosa de L‑Cys 0.02 M durante 30 minutos en la oscuridad. A continuación, sobre la superficie del electrodo L-Cys-P3MT-MWCNTs-GCE, se depositan 10 µL de una disolución de Cyt c 0.6 mg mL-1 preparada en medio regulador fosfato 0.1 M de pH 7.0 y se deja evaporar el disolvente a temperatura ambiente. El empleo del aminoácido L-Cys asegura la presencia de sitios cargados negativamente que pueden interaccionar con las cargas positivas del Cyt c, haciendo posible la inmovilización electrostática de la metaloproteina 2.
Se estudió el comportamiento voltamperométrico de las disoluciones de H2O2 sobre el biosensor Cytc-L-Cys-P3MT-MWCNTs-GCE, observándose la aparición de un pico catódico a -400 mV en medio Tris-HCl 0.05 M de pH 8, cuya intensidad aumenta en presencia del peróxido. La medida en amperometría en discontinuo de la corriente de reducción a 0 mV permitió obtener un calibrado lineal para H2O2 entre 0.7 y 400 µM, con una pendiente de 1.26 nA/µM y un límite de detección de 0.2 µM. La región de saturación del calibrado se alcanza para una concentración de H2O2 superior a 600 µM, con un comportamiento del tipo Michaelis-Menten. La constante cinética, KMap, obtenida de la representación de Lineaweaver-Burk, 451 µM, es considerablemente menor que las estimadas para otros biosensores de citocromo c encontrados en la bibliografía 3, lo que demuestra la elevada afinidad del biosensor Cyt c-L-Cys-P3MT-MWCNTs-GCE hacia el H2O2. Además, se alcanzó una buena repetibilidad de las señales, con RSD = 3.1% (n=5), y una buena reproducibilidad para el procedimiento de preparación de los biosensores, con RSD = 8% (n=5). La estabilidad se ha evaluado midiendo la respuesta del biosensor cada día, encontrándose que retiene el 85% de la respuesta original transcurridos 8 días cuando se almacena a 4ºC en regulador fosfato 0.05 M de pH 8.0.
Se investigó la influencia de posibles interferentes: ácido úrico (UA), DOPAC, dopamina (DA), catecol, ácido homovanílico (HVA), ácido 5-hidroxiindol-3-acético (HIAA), acetaminofeno (A), dimetilsulfóxido (DMSO) y ácido ascórbico (AA), sobre la señal de H2O2 1.0 x 10‑5 M, observándose interferencia únicamente en presencia de AA al mismo nivel de concentración. Por otro lado, esta interferencia puede ser evitada por deposición de una película polimérica de Nafion sobre la superficie del electrodo de trabajo.
Como aplicación, el biosensor Cytc-L-Cys-P3MT-MWCNTs-GCE ha sido empleado para la determinación de radicales superóxido.
