Nanotubos de carbono de pared múltiple funcionalizados con avidina: una plataforma multipropósito. Aplicaciones para el desarrollo de un genosensor dirigido a la cuantificación de BRCA1

MICHAEL LÓPEZ MUJICA; MARÍA DOLORES RUBIANES; GUSTAVO A. RIVAS

Congreso; XI CONGRESO ARGENTINO DE QUÍMICA ANALÍTICA; 2021

El gen BRCA1 (Breast Cancer 1) es supresor de tumores, y juega un rol fundamental en la reparación de ADN, la ubiquitinación de proteínas, apoptosis. Sin embargo, se ha encontrado que existe una sobreexpresión de este gen en ciertos tipos de cáncer, principalmente de ovarios, páncreas, colon y mama, por lo que se ha convertido en un biomarcador de relevancia para el diagnóstico de tales patologías. En este trabajo se desarrolló un nano(bio)sensor para la cuantificación directa de BRCA1, sin requerimiento de estrategias de amplificación, basado en el uso de una plataforma de nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNTs) funcionalizados con avidina (Av) (MWCNTs-Av). A diferencia de otros esquemas de preparación de biosensores basados en MWCNTs funcionalizados no covalentemente, en los que la capa de biorreconocimiento se construye sobre el electrodo, en este caso dicha plataforma se usó para inmovilizar la sonda de ADN biotinilado (bDNAp) mediante agitación durante 60 minutos (MWCNTs-Av-bDNAp) y, una vez obtenida la capa de biorreconocimiento se depositó sobre electrodos de carbono vítreo (GCE) o electrodos serigrafiados de carbono (SPCE). Luego de la evaporación del solvente, se incorporó albúmina sérica bovina (BSA) como agente bloqueante superficial. La hibridación se realizó a temperatura ambiente en ?buffer? fosfato 0,050 M pH 7,40 y la transducción, se realizó empleando espectroscopía de impedancia electroquímica (EIE), empleándose los cambios en la resistencia a la transferencia de carga (RTC) de un mediador rédox ([Fe(CN)6]3+/2+) como señal analítica. El análisis por FTIR del espectro de MWCNTs-Av-bDNAp mostró las típicas bandas de enlaces peptídicos de Av a 1645 cm-1 y 1530 cm-1, asociadas al estiramiento C=O de la amida I y a la torsión de los grupos N-H de la amida II, respectivamente. Además, se observó una región entre 1250 y 1000 cm-1, que corresponde a las vibraciones de los enlaces azúcar-fosfato en el esqueleto del ADN, demostrándose la exitosa inmovilización del bDNAp en la dispersión de MWCNTs-Av. Se evaluó la especificidad de la interacción de bDNAp con MWCNTs-Av empleando EIS y resonancia de plasmón superficial (SPR). Los cambios en la RTC luego de la interacción de MWCNTs-Av con bDNAp y DNAp fueron 5115 Ὠ y 3394 Ω; en tanto que los cambios de ángulo del plasmón (Δθ), fueron 312 °m y 29 °m respectivamente, claramente indicando que bDNAp interactúa específicamente con la plataforma y que la adsorción inespecífica es despreciable. El genosensor permitió obtener una respuesta lineal frente a BRCA1 para concentraciones comprendidas entre 1,0 x 10-15 M y 1,0 x 10-8 M, con una sensibilidad de (460 ± 9) ΩM-1 (r2 = 0.997) y un límite de detección de 330 aM. La reproducibilidad del biosensor empleando una misma plataforma fue de 5,2 % y 4,6 % para concentraciones de BRCA1 de 1,0 x 10-12 M y 1,0 x 10-14 M respectivamente; en tanto que, para cuatro plataformas diferentes y una concentración de BRCA1 de 1,0 x 10-12 M, se obtuvo una reproducibilidad de 5,2 %. La selectividad se evaluó utilizando dos secuencias completamente no complementarias y una secuencia con 5 mutaciones puntuales, así como mezcla de ellas con BRCA1, no evidenciándose en ningún caso interferencia en la determinación del analito. Se evaluó la posible aplicación práctica del biosensor a través de estudios de recuperación llevados a cabo en muestras de suero humano diluido con ?buffer? fosfato 0,050 M pH 7,40 + NaCl 0.500 M (1/1000 y 1/100) y enriquecido con BRCA1, obteniéndose porcentajes de recuperación de 96 % y 93 %, respectivamente. Teniendo en cuenta la importancia de la miniaturización y la portabilidad en el desarrollo de sensores, se investigó el desempeño analítico de SPCEs modificados con MWCNTs-Av-bDNAp, obteniéndose un intervalo lineal entre 1,0 x 10-15 M y 1,0 x 10-10 M, una sensibilidad de (27 ± 1) ΩM-1 (r2 = 0.991) y un límite de detección de 330 aM, indicadores de una exitosa aplicación de MWCNTs-Av-bDNAp.Los resultados presentados dan evidencia de la importancia de la plataforma de MWCNTs como soporte específico para la construcción de capas de biorreconocimiento de un modo equivalente, pero más simple y menos costoso, que las nanopartículas magnéticas, abriendo las puertas a nuevos desarrollos de diversos biosensores.