El depósito de glucuronoxilomanano de Cryptococcus neoformans en tejidos de ratas normales induce un perfil de citoquinas Th2 y apoptosis
Introducción:
La cápsula de Cryptococcus neoformans, constituída en un 88 % de glucuronoxilomanano (GXM), representa uno de los principales factores de virulencia del hongo debido a sus propiedades antifagocíticas e inmuomoduladoras. Durante la criptococosis diseminada se observa depósito de GXM en los órganos infectados y altos niveles en suero y LCR. Recientemente demostramos que GXM, in vitro, suprime la proliferación de linfocitos T, induce citoquinas Th2 y muerte celular por apoptosis en células de bazo de ratas normales.
Objetivos
El objetivo de este trabajo fue investigar los efectos in vivo de GXM sobre la respuesta inmune de ratas normales. Con este propósito, durante dos semanas estudiamos:
- La distribución y depósito de GXM en distintos órganos
- La respuesta blastogénica y perfil de citoquinas de esplenocitos de ratas inoculadas con GXM, estimulados con un mitógeno de células T (Con A)
- La inducción de apoptosis en los órganos con depósito de polisacárido
Resultados
6 días postinoculación con GXM
Figura 1: GXM se deposita en bazo, pulmón e hígado e induce alteraciones histológicas en pulmón de ratas normales
Inmunohistoquímica (IHQ) para GXM con el anticuerpo específico 2H1 (Casadevall A.) e histología con hematoxilina-eosina (H/E) en cortes de tejido. (A) Pulmón: IHQ para GXM (200x), se observa moderada marca positiva sectorizada, intracelular y extracelular. (B) Pulmón: H/E (200x), septos muy engrosados, infiltrado mononuclear y presencia de eosinófilos (flechas). (C) Bazo: IHQ para GXM (100x), marca positiva difusa (intra y extracelular) en toda la pulpa roja. Moderada marca positiva intracelular en pulpa blanca. (D) Hígado: IHQ para GXM (200x), células de kupffer con marca positiva intracelular citoplasmática. La reacción de color fue desarrollada con DAB-H2O2 y las muestras contracoloreadas con hematoxilina.
Figura 2: Incrementados niveles de IL-2, INFg e IL-10 en esplenocitos de ratas inoculadas con GXM
(A) Respuesta proliferativa de esplenocitos de ratas normales e inoculadas con GXM. La proliferación celular fue medida en cultivos de esplenocitos en ausencia o presencia de Con A (96h a 37º C y 5% de CO2), por incorporación de timidina tritiada (CPM: cuentas por minuto). En ausencia de Con A (basales) se observa incremento en la proliferación de los esplenocitos de ratas inoculadas respecto a las ratas sin tratamiento (p < 0,05). En presencia de Con A no hay diferencias en la proliferación. (B) Cuantificación de Citoquinas en el sobrenadante de cultivos. Los niveles de citoquinas fueron determinados por ELISA de captura en los sobrenadantes de cultivos de esplenocitos de ratas normales e inoculadas con GXM estimulados con Con A. Se observa incrementados niveles de IL-2, INFg e IL-10 en los esplenocitos de ratas inoculadas respecto a los controles. (& p <0,002, * p< 0,02 y **p < 0,03). No se observan diferencias en la producción de TNFa en los animales inoculados con respecto a los controles.
Figura 3: GXM induce apoptosis en pulmón luego de 6 días post-inoculación
Detección in situ de apoptosis por la reacción de TUNEL en pulmón de ratas inoculadas con GXM. La foto (400x) muestra células apoptóticas (flechas) y células con metacromasia indicando la presencia de polisacárido
14 días postinoculación con GXM
Figura 4: GXM persiste en bazo, pulmón e hígado de ratas normales luego de 14 días post-inoculación
Inmunohistoquímica para GXM contrateñida con hematoxilina en cortes de tejidos. (A) Pulmón (200x): Septos ligeramente engrosados. Marca positiva intracelular citoplasmática y extracelular. (B) Bazo (100 x): marca positiva difusa (intra y extracelular) en toda la roja. Moderada marca positiva intracelular en pulpa blanca. (C) Hígado (200x): células de kupffer con marca positiva intracelular citoplasmática
Figura 5: Supresión de la respuesta proliferativa, disminución en los niveles de IL-2 y TNFa e incrementados niveles de IL-10 en esplenocitos de ratas inoculadas con GXM.
(A) Respuesta proliferativa de esplenocitos de ratas normales e inoculadas con GXM. Se observa supresión de la proliferación a Con A de esplenocitos de ratas inoculadas respecto a los controles (* p < 0,04). (B) Cuantificación de citoquinas en los sobrenadantes de cultivo de los esplenocitos estimulados con Con A. Los animales inoculados con GXM muestran: disminución en la producción de IL-2 y TNFa con un incremento en la producción de IL-10 respecto a los controles (# p < 0,001, * p < 0,001 y & p < 0,05). No se observan modificaciones significativas en los niveles de INFg en las ratas inoculados con respecto a los controles.
Figura 6: La persistencia de GXM luego de 14 dias post-inoculación induce marcados niveles de apoptosis en pulmón
Reacción de TUNEL en cortes de pulmón contracoloreados con verde de metilo. La foto muestra numerosas células apoptóticas en pulmón de ratas inoculadas con GXM.
Conclusiones
Durante la primera semana luego de la administración de GXM vía intracardíaca en ratas Wistar se observa
- Depósitos de GXM intra y extacelular en bazo, pulmón e hígado.
- Importantes cambios histológicos, eosinofilia y apoptosis en pulmón.
- Activación de la respuesta inmune celular (incremento en la proliferación espontánea de las células de bazo y producción de citoquinas Th1)
Luego de 2 semanas se observa:
- Persistencia de los depósitos intra y extacelular de GXM
- Incremento en los niveles de apoptosis en pulmón respecto a la primer semana
- Supresión de la respuesta proliferativa de linfocitos de bazo con un perfil de citoquinas Th2
