Introducción:
La apoptosis de células del sistema inmune puede ser un mecanismo de patogénesis microbiana que permite a distintos microorganismos evadir la respuesta inmune y persistir en el huésped infectado. Cryptococcus neoformans es un hongo patógeno intracelular facultativo que causa infecciones diseminadas en pacientes inmunosuprimidos y micosis persistentes en húespedes inmunocompetentes. Un importante factor de virulencia de esta levadura es la presencia de una cápsula de polisacáridos constituída en un 88 % de glucuronoxilomanano (GXM). Durante la criptococosis diseminada se observan diferentes fenómenos de inmunosupresión y GXM es un reconocido agente antiinflamatorio y modulador de la inmunidad mediada por células. Recientemente observamos que GXM disminuye marcadamente el número de linfocitos de ratas normales in vitro. Paralelamente, observamos que el número de linfocitos provenientes de ratas en el período inmunosupresor de la criptococosis diseminada (14 días postinfección con C. neoformans), disminuye espontáneamente luego de cultivos in vitro. En base a estos resultados hipotetizamos que GXM induce apoptosis de células inmunes, y este fenómeno de muerte celular programada está presente en el período inmunosupresor de la infección experimental con C. neoformans.
Objetivo:
El objetivo de este trabajo fue determinar si el principal polisacárido de Cryptococcus neoformans,glucuronoxilomanano, induce apoptosis en esplenocitos in vitro y estudiar si durante el período
inmunosupresor de la infección experimental en ratas con el hongo se induce apoptosis en los órganos infectados
Materiales y métodos
Obtención de glucuronoxilomamano:
GXM fue obtenido de acuerdo al método descripto por Cherniak y col. Brevemente, se realizaron cultivos de Cryptococcus neoformans var neoformans en un medio líquido químicamente definido y GXM fue obtenido por precipitación con etanol y CTAB. La concentración de carbohidratos neutros se determinó por el método de Dubois y col.
Animales e infección
Ratas Wistar hembras de
Estudio de la inducción de apoptosis por GXM en esplenocitos de ratas normales
Se realizaron cultivos de esplenocitos de ratas normales en RPMI 1640 (Sigma) a 37°C presencia o ausencia de GXM (50 mg/ml). Luego de 24 h se obtuvieron las células y se determinó la fragmentación del DNA característica de apoptosis por extracción del DNA y análisis electroforético en gel de agarosa y reacción de TUNEL (Boehringer Mannheimm) en preparados de citospin. Se observaron además las características morfológicas de la apoptosis en preparados de citospin teñidos con May-Gründwald-Giemsa. Se cuantificó el contenido de DNA hipodiploide por tinción con ioduro de propidio (PI) y análisis por citometría de flujo.
Estudio de la inducción de apoptosis durante la infección experimetal con C. neoformans
Se determinó la inducción de apoptosis por reacción de TUNEL en secciones de tejido de los órganos fijados con formaldehído e incluídos en parafina de ratas normales e infectadas. Por otra parte se realizó el análisis por citometría de flujo de esplenocitos inmediatamente obtenidos de ratas normales e infectadas y luego de distintas horas de cultivo, marcados con PI.
Conclusiones:
· GXM induce apoptosis de esplenocitos luego de cultivo
· Esplenocitos de ratas infectadas con C. neoformans muestran aumento en el porcentaje de células apoptóticas luego de cultivo.
· Durante el período supresor de la criptococosis diseminada
