Identificación de dermatofitos por PCR fingerprinting con (GACA)4, (GTG)5 o M13

SPESSO FLORENCIA; NUNCIRA TANIA (HOSPITAL PEDIÁTRICO DEL NIÑO JESÚS, CÓRDOBA); DIB MOISÉS (HOSPITAL PEDIÁTRICO DEL NIÑO JESÚS, CÓRDOBA); MASIH DIANA T; CHIAPELLO LS

Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiología; 2010

Asociación Argentina de Microbiología

Objetivo: estandarizar la técnica  PCR fingerprinting para identificar especies de dermatofitos utilizando primers que hibridan con secuencias mini y microsatélites dispersas en el genoma.

Materiales y métodos: Se recolectaron muestras de pacientes con sospecha clínica de dermatofitosis concurrentes al Servicio de Dermatología del Hospital Pediátrico del Niño Jesús  de Córdoba Capital. Las muestras fueron procesadas para examen directo con KOH 40% y cultivadas en medio de sabouraud y agar papa dextrosa. Luego de 20 días, se procedió a la tipificación de los cultivos positivos por las características macro y microscópicas de las colonias. Para la extracción de material genético se seleccionaron los siguentes dermatofitos: Microsporum canis (n=40), Microsporum gypseum (n=5), Trichophyton rubrum (n=13), Trichophyton mentagrophytes var. mentagrophytes (n=12) y Trichophyton tonsurans (n=1). Se obtuvo el ADN genómico a partir del micelio crecido en las colonias puras en pico de flauta, por pulverización con mortero y aire líquido, y la posterior extracción con fenol-cloroformo. Las reacciones de amplificación se realizaron utilizando los siguientes primers: (GACA)₄ (5´-GACA GACA GACA GACA-3´), (GTG)₅ (5´-GTG GTG GTG GTG GTG-3´) o M13  (5´-GAGGGTGGCGGTTCT-3´). Luego de la amplificación, se corrieron gel de agarosa al 2% con el agregado de SybreSafe (Invitrogen) para la visualización, a 50 V por 75 minutos en buffer TAE 1x. La reproducibilidad de las técnicas con los diferentes primers se evaluó realizando extracciones de DNA por duplicado y amplificando las muestras en reiteradas ocasiones. El análisis de las imágenes se realizó con el programa GEL-PRO ANALIZER  3.1.00.00.

Resultados: En general, se observaron bandas con pesos moleculares en el rango de 300 a 1300 pb y de complejidad variable luego de la amplificación del ADN fúngico utilizando PCR con cualquiera de los tres primers. La PCR con (GACA)₄ mostró los perfiles de bandas más sencillos y reproducibles (entre 1 y 5 bandas dependiendo del hongo) con patrones característicos y distintivos para M. canis, M. gypseum y T. rubrum. Sin embargo, la PCR con (GACA)₄ no permitió diferenciar T. mentagrophytes de T. tonsurans, ya que ambas especies mostraron perfiles genéticos idénticos. La PCR con (GTG)₅ mostró patrones de bandas más complejos que los observados con (GACA)₄ pero se obtuvo un perfil de bandas característico para cada una de las especies fúngicas analizadas. Finalmente, la PCR con M13 mostró perfiles de bandas más complejos que los observados con (GACA)₄ y con patrones distintivos para M. canis, M. gypseum y T. rubrum, pero no permitía diferenciar  T. mentagrophytes de T.  tonsurans.

Conclusiones: La PCR fingerprinting con (GACA)₄ es un método simple, rápido y reproducible para identificar M. canis, M. gypseum y T. rubrum. Los perfiles constituidos por un gran número de bandas obtenidos con la PCR fingerprinting con (GTG)₅  dificultan la reproducibilidad de la técnica, por lo cual se lo propone como un segundo paso, cuando la especie hallada no puede ser distinguida utilizando (GACA)₄.