Triiodotironina (T3) ejerce sus efectos a través de su unión a receptores nucleares específicos (RT3), los cuales se unen como heterodímeros principalmente con el receptor del ácido 9 cis-retinoico (RXR) a secuencias específicas de DNA respondedoras a hormonas tiroideas, presentes en los genes regulados por T3. Es bien conocido el aumento inducido por glucocorticoides (GCs) en diversas acciones metabólicas específicas de T3 en ensayos in vivo e in vitro. En estudios previos in vivo demostramos que la administración de Dexametasona (Dex), un glucocorticoide de síntesis, a ratas (250 mg/100 g de peso corporal por 48 hs) indujo un incremento en los niveles de RT3 b1 en tejido hepático tanto a nivel de su proteína como de su RNAm. Un efecto similar fue inducido sobre los niveles de RXR total a nivel proteico en hígado. En este trabajo profundizamos el estudio del mecanismo molecular del efecto de Dex sobre RT3. Evaluamos: a) la velocidad transcripcional del gen de RT3 en núcleos hepáticos de ratas machos adultas controles y tratadas con Dex (ensayo de run-on nuclear), b) la unión de proteínas nucleares de hígado de rata controles y tratadas con Dex a probables secuencias consenso para la unión de receptores de GCs (GR) presentes en el promotor del RT3 (ensayos de retraso en gel), c) el efecto de Dex in vitro sobre la actividad transcripcional del promotor de RT3 b1 (ensayos de transfección). Para este último objetivo células COS-7 fueron transfectadas con el plásmido pGL-2 conteniendo la región –1325 pb a +44 pb del promotor de RT3 acoplado al gen reportador: luciferasa (Luc) (pRT3Luc) y los vectores de expresión del RT3 y el GR. A fin de normalizar los resultados se utilizó un plásmido reportador b galactosidasa (b gal). Luego de 24 hs de la transfección, las células fueron expuestas a diferentes concentraciones de Dex por distintos períodos de tiempo en ausencia o presencia de T3 10-7M. Estadística: Análisis entre grupos se realizó por ANOVA seguido del test de comparaciones múltiples de Student-Newman-Keuls. Comparaciones entre dos grupos fueron realizadas por Student “t” test. Valores p< 0.05 fueron considerados significativos.
RESULTADOS: a) Dex incrementó la velocidad de transcripción del gen de RT3 en un 209% (unidades arbitrarias; media ± SEM); control: 0,122 ± 0,05; Dex: 0,378 ± 0,005, n= 5; p< 0,005. b) Por análisis computacional del promotor de RT3 fueron localizadas dos posibles secuencias consenso para GR (regiones 839/834 y 667/662 upstream del sitio de inicio de la transcripción). Sobre esta información se diseñaron oligonucleótidos de 25 pb manteniendo la secuencia del promotor de las regiones: -850/-824 y -678/-652. Ensayos de retraso en gel utilizando como sonda el oligonucleótido -850/-824 evidenciaron mayor abundancia de los complejos formados con la incubación de extractos nucleares hepáticos de ratas tratadas con Dex que con los controles. Con la incubación de los extractos nucleares con un anticuerpo contra GR se observó la disminución de los complejos formados, lo que indicaría la presencia del GR en dichos complejos. Sin embargo, los ensayos realizados utilizando como sonda el oligonucleótido -678/-652 no evidenciaron cambios en los complejos formados entre el grupo control y tratado con Dex. c) En células COS-7 transfectadas con pRT3Luc, Dex (10-9M y 10-8M) incrementó la actividad transcripcional de dicho promotor. La incubación de Dex por 12 hs indujo un incremento en la actividad de pRT3Luc de 120% (p<0.01) en presencia de T3, sin respuesta en su ausencia; mientras que el estudio a las 24 hs evidenció un incremento de la actividad de pRT3Luc tanto en ausencia como en presencia de T3 (100% y 70% respectivamente, p< 0.05). La incubación de Dex por 48 hs indujo un aumento de la actividad de pRT3Luc solo en presencia de T3, (150% p<0.05).
CONCLUSIONES: Estos resultados indican que el mecanismo molecular involucrado en el incremento observado en las acciones metabólicas específicas de T3 por la acción de Dex, involucra un efecto sobre la transcripción del gen de RT3 demostrado tanto in vivo como in vitro. Además, existiría una interacción directa del GR sobre el promotor de RT3, indicando que el menos en parte, el efecto de los GC sería ejercido directamente por la interacción de su receptor con secuencias consenso en el promotor del gen que codifica a RT3.
