Evaluación del rol de sistemas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos en la resistencia de Proteus mirabilis a ciprofloxacina

AIASSA V, BARNES AI, SMANIA AM; ALBESA INÉS

Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiología; 2010

Asociación Argentina de Microbiología

Introducción Los mecanismos primarios de resistencia a quinolonas son las mutaciones en la ADN girasa y topoisomerasa IV y la disminución de la cantidad de droga acumulada debido a procesos de eflujo o a cambios en las proteínas de membrana externa. Resultados previos de nuestro laboratorio indican que varios antibióticos (ATB), incluyendo ciprofloxacina (CIP), estimulan la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) en células bacterianas. Posteriormente, se relacionaron a las ROS con la resistencia a ATB ya que niveles subletales de estos inducen mutagénesis resultando en un incremento de resistencia a los mismos. Objetivo Evaluar en variantes resistentes (VR) a CIP de P.mirabilis mecanismos clásicos de resistencia a CIP (mutaciones en GyrA, GyrB y ParC) y sistemas de defensas antioxidantes tales como superóxido dismutasa (SOD), glutatión (GSH) y capacidad antioxidante total para investigar la posible asociación de las defensas antioxidantes en la resistencia de esta bacteria a CIP. Materiales y métodos Se utilizaron 3 cepas bacterianas de origen clínico 2 sensibles (S1, S2) y 1 resistente (R3) y 4 VR obtenidas en nuestro laboratorio a partir de S1 y S2 denominadas R1a, R1b, R2a y R2b. Los fragmentos de gyrA, gyrB y parC donde se hallan las mutaciones mas frecuentes de cada cepa bajo estudio fueron amplificados por PCR y secuenciados directamente por Macrogene Corp USA. La actividad SOD se determinó a 560 nm utilizando Azul de Nitrotetrazolio en presencia de riboflavina. El GSH total se analizó mediante la reacción del GSH reducido con el ácido 5,5´-ditiobis-nitrobenzoico en presencia de GSH reductasa y NADPH en exceso. La capacidad antioxidante total se cuantificó por el ensayo FRAP (Ferric reducing antioxidant power assay) por reducción del complejo Fe³+-2,4,6-tris (2-piridil)-1,3,5-triazina (TPTZ) a su forma ferrosa y posterior monitoreo a 593 nm. Resultados Notablemente, no se hallaron mutaciones en GyrA, GyrB o ParC en ninguna de las VR, las cuales mostraron secuencias inalteradas al ser comparadas con las secuencias correspondientes a P.mirabilis ATCC 29906. Por su parte la cepa clínica R3 usada como control positivo mostró las mutaciones descriptas para esta bacteria en la región determinante de resistencia a quinolonas (QRDR), S83 (GyrA), E466 y S80 (GyrB) y E84 (Par C). En cuanto a las VR, éstas además de mostrar mayor resistencia a CIP (CIM: R1a 16 µg/ml, R1b 4 µg/ml, R2a 8 µg/ml y R2b 4 µg/ml) que sus respectivas wild type (wt, CIM: S1 0,125 µg/ml y S2 2 µg/ml) exhibieron mayor actividad SOD intra y extracelular, mayores niveles de GSH y además las VR con mayor CIM (R1a y R2a) tuvieron una capacidad antioxidante total significativamente mayor que sus wt. Conclusiones Los resultados obtenidos sugieren que CIP induce resistencia al estrés oxidativo en P.mirabilis, lo que puede consecuentemente actuar como mecanismo de resistencia al mismo ATB. Este aspecto puede ser sumado a la lista de factores que regulan la susceptibilidad a CIP, teniendo en cuenta la naturaleza multifactorial de la resistencia a ATB.