Biomarcadores de estres oxidativo en cepas clínicas de Proteus mirabilis formadoras de biofilm.

AIASSA, V.; BARNES, A.; ALBESA, I

Córdoba

Congreso; XII Congreso SADI 2012; 2012

Sociedad Argentina de Infectología

ANTECEDENTES: Las infecciones causadas por bacterias que se encuentran formando biofilms son particularmente problemáticas dado que las células sésiles son más resistentes a la respuesta inmune del huésped y más tolerantes a antibióticos (ATB), biocidas y fuerzas hidrodinámicas que su contraparte planctónica. Proteus mirabilis presenta gran habilidad para adherirse a catéteres y formar biofilms estableciendo y manteniendo infecciones del tracto urinario y produciendo un arsenal de factores de virulencia estrictamente regulados. Ciprofloxacina (CIP) es un ATB que puede utilizarse en el tratamiento de infecciones urinarias y dado que está descripto que produce estrés oxidativo en bacterias resulta factible pensar que podría actuar a través del estímulo de la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) provocando consecuentemente la oxidación de macromoléculas bacterianas tales como lípidos y proteínas, considerados biomarcadores de alteración oxidativa. OBJETIVO: Evaluar en forma comparativa la oxidación de lípidos y proteínas en células planctónicas y biofilms de P. mirabilis expuestos a CIP para contribuir a una mayor comprensión de la regulación de las ROS con la consecuente oxidación de macromoléculas en biofilms y su relación con la resistencia a CIP. MATERIALES Y MÉTODOS: Se utilizaron 6 cepas de P. mirabilis, 2 cepas sensibles (S) denominadas S1 y S2, y 4 cepas resistentes (R) designadas como 1X, 1Y, 2X y 2Y. Los biofilms se formaron sobre membranas Millipore estériles inoculadas con 0,5 ml de un cultivo overnight de P. mirabilis y cultivadas en Agar Tripteína Soya por 24 h a 37 ºC. Las células planctónicas (S y R a CIP) y los biofilms fueron expuestos a CIP o a buffer fosfato (para determinar las concentraciones basales) previamente a la determinación de malondialdehído (MDA), grupos carbonilo (GC) y productos proteicos de oxidación avanzada (AOPP). El MDA fue utilizado como biomarcador de la oxidación lipídica cuantificando el producto resultante de la reacción del mismo con el ácido tiobarbitúrico a 535 nm. Mientras que los GC y AOPP se utilizaron como biomarcadores de la oxidación de proteínas. Los GC se cuantificaron mediante el uso de dinitrofenilhidrazina que conduce a la formación de hidrazonas estables que pueden determinarse por espectrofotometría y los AOPP por un ensayo colorimétrico con yoduro de potasio y ácido acético usando cloramina T como estándar. RESULTADOS: En estado planctónico, luego de la incubación con CIP las cepas S1 y S2 incrementaron los niveles de peroxidación lipídica un 37,5 % y 17,9 % respectivamente mientras que las cepas R no sufrieron incrementos significativos. Al evaluar la oxidación de proteínas frente a CIP se observó aumento de los GC y de los AOPP tanto en las cepas S y como en las R siendo el incremento de los GC mayor en las cepas S que en las R (70,2 % en S1 y 40,5 % en S2). Al evaluar lo sucedido en biofilms en comparación con las células planctónicas respecto a la oxidación de macromoléculas; los resultados demostraron que en condiciones basales el biofilm presentó mayor concentración de macromoléculas oxidadas que su contraparte planctónica. Sin embargo, frente al ATB no se detectaron incrementos en la oxidación de lípidos ni de proteínas. CONCLUSIONES: En el biofilm la falta de crecimiento celular constante conduce a que las mismas células permanezcan expuestas a las ROS por mayor tiempo, esto lleva a la acumulación del daño oxidativo con altos niveles de oxidación de macromoléculas en condiciones basales, mientras que al ser incubados con CIP su mayor resistencia a ATB hace que no se incrementen los niveles de los biomarcadores evaluados como ocurre en el estado planctónico.