AIASSA VIRGINIA
Congresos y reuniones científicas
Título:
Determinación de glutatión y catalasa en células planctónicas y biofilms de Proteus mirabilis frente a ciprofloxacina
Autor/es:
AIASSA VIRGINIA, BARNES ANA ISABEL, VÉLEZ ESTELA PAOLA, ALBESA INÉS
Lugar:
Córdoba
Reunión:
Congreso; XI Congreso Argentino de Microbiología; 2007
Institución organizadora:
Asociación Argentina de Microbiología
Resumen:
Las especies reactivas del oxígeno (ROS)cumplen un destacado rol en los procesos
fisiológicos de las células. Los organismos aeróbicos articulan sus defensas a través de
sistemas en los que enzimas como catalasa (CAT) y moléculas como el glutatión, previenen
la formación de ROS o inhiben sus reacciones con estructuras biológicas.
Dado que CAT cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno y
que el glutatión constituye una molécula cuya concentración es crítica para modular la
producción de ROS, resulta necesario estudiar el rol de ambos factores en la protección de
las bacterias, tanto en estado planctónico como en biofilms; teniendo en cuenta que las
bacterias en biofilms presentan una mayor resistencia a los antibióticos y modifican su
metabolismo respiratorio.
El objetivo de este estudio fue evaluar la producción de glutatión y la actividad CAT de
P.mirabilis wild type (wt) y variantes resistentes X y S (VR), en condiciones
basales y frente a Ciprofloxacina (CIP) en células planctónicas y en biofilms.
Los biofilms se formaron sobre membranas Millipore estériles inoculadas con 0,5 ml de un
cultivo overnight de P.mirabilis (DO600=0,200) y cultivadas en Agar Tripteína Soya
por 24 h a 37ºC.
Las células planctónicas y los biofilms fueron expuestos a CIP 4 mg/L o a buffer fosfato
(basal) durante 2 h previo a la determinación de glutatión y CAT.
El glutatión total se determinó mediante la reacción de glutatión reducido (GSH) con el
ácido 5,5´-ditiobis-nitrobenzoico en presencia de glutatión reductasa y NADPH en exceso.
La actividad CAT se determinó por un ensayo espectrofotométrico con peróxido de
hidrógeno, dicromato de potasio y ácido acético.
Las VR planctónicas en condiciones basales incrementaron al doble sus niveles de GSH y
disminuyeron un 14% la actividad CAT en relación a las wt. En biofilms los niveles de
GSH producidos fueron en promedio el doble comparado con las células planctónicas. Se
apreció una disminución media de los niveles de CAT del 54% en 5 cepas, excepto una VR
que mantuvo el mismo valor de la CAT que en su estado planctónico. Frente a CIP la
producción de GSH fue variable y se observó una reducción promedio de la CAT del 20%
en células planctónicas y en biofilms.
El GSH es el tiol mas abundante de las células resultando imprescindible para mantener el
equilibrio redox intracelular; y en este trabajo se demostró que las cepas de
P.mirabilis resistentes a CIP presentaron mayores niveles de GSH en estado basal.
El mismo fenómeno pudo apreciarse en el biofilm que es un estado de resistencia natural de
las bacterias. Frente a CIP la respuesta de GSH fue variable tanto en células planctónicas
como en biofilms, mientras que la actividad CAT disminuyó.
fisiológicos de las células. Los organismos aeróbicos articulan sus defensas a través de
sistemas en los que enzimas como catalasa (CAT) y moléculas como el glutatión, previenen
la formación de ROS o inhiben sus reacciones con estructuras biológicas.
Dado que CAT cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno y
que el glutatión constituye una molécula cuya concentración es crítica para modular la
producción de ROS, resulta necesario estudiar el rol de ambos factores en la protección de
las bacterias, tanto en estado planctónico como en biofilms; teniendo en cuenta que las
bacterias en biofilms presentan una mayor resistencia a los antibióticos y modifican su
metabolismo respiratorio.
El objetivo de este estudio fue evaluar la producción de glutatión y la actividad CAT de
P.mirabilis wild type (wt) y variantes resistentes X y S (VR), en condiciones
basales y frente a Ciprofloxacina (CIP) en células planctónicas y en biofilms.
Los biofilms se formaron sobre membranas Millipore estériles inoculadas con 0,5 ml de un
cultivo overnight de P.mirabilis (DO600=0,200) y cultivadas en Agar Tripteína Soya
por 24 h a 37ºC.
Las células planctónicas y los biofilms fueron expuestos a CIP 4 mg/L o a buffer fosfato
(basal) durante 2 h previo a la determinación de glutatión y CAT.
El glutatión total se determinó mediante la reacción de glutatión reducido (GSH) con el
ácido 5,5´-ditiobis-nitrobenzoico en presencia de glutatión reductasa y NADPH en exceso.
La actividad CAT se determinó por un ensayo espectrofotométrico con peróxido de
hidrógeno, dicromato de potasio y ácido acético.
Las VR planctónicas en condiciones basales incrementaron al doble sus niveles de GSH y
disminuyeron un 14% la actividad CAT en relación a las wt. En biofilms los niveles de
GSH producidos fueron en promedio el doble comparado con las células planctónicas. Se
apreció una disminución media de los niveles de CAT del 54% en 5 cepas, excepto una VR
que mantuvo el mismo valor de la CAT que en su estado planctónico. Frente a CIP la
producción de GSH fue variable y se observó una reducción promedio de la CAT del 20%
en células planctónicas y en biofilms.
El GSH es el tiol mas abundante de las células resultando imprescindible para mantener el
equilibrio redox intracelular; y en este trabajo se demostró que las cepas de
P.mirabilis resistentes a CIP presentaron mayores niveles de GSH en estado basal.
El mismo fenómeno pudo apreciarse en el biofilm que es un estado de resistencia natural de
las bacterias. Frente a CIP la respuesta de GSH fue variable tanto en células planctónicas
como en biofilms, mientras que la actividad CAT disminuyó.
