Actividad antimicrobiana de nuevos nanofotosensibilizadores.

Simposio; SIMPOSIO IBEROAMERICANO EN LÍNEA COIFFA 2022 SALUD GLOBAL Y SOSTENIBILIDAD; 2022

C O NFERE NCIA I BEROA M E R I CAN A D E F A CULTADE S D E F A R MAC I A A.C.

INTRODUCCIÓN: La Terapia Fotodinámica Antimicrobiana (TFDA) es un tratamiento mínimamenteinvasivo que requiere una combinación simultánea de un fotosensibilizador (FS), luz de una longitudde onda específica y oxígeno molecular. Estos tres elementos no son tóxicos por sí solos, pero sucombinación desencadena un efecto basado en la generación de especies reactivas de oxígeno(ROS), que promueven el daño oxidativo y la destrucción celular y son altamente citotóxicos para lasbacterias, incluso contra las resistentes a los antibióticos. Los derivados monobromados de RojoNeutro (NRBr) y Azure B (AzBBr) han sido sintetizados y evaluados por nuestro grupo de investigación(Urrutia MN et al, 2013; Monte de Oca MN et al, 2013). Estos FS presentan una prometedora eficaciafotodinámica frente a Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, aunqueposeen algunos problemas de solubilidad, agregación y estabilidad en medios acuosos a pHfisiológico. Las nanopartículas de poliacrilamida (NPs-PAA) son biocompatibles, no producentoxicidad, y pueden administrarse sistémicamente debido a sus propiedades altamente solubles enagua. La PAA es un polímero que evita la agregación del FS e incluso, existen numerososantecedentes que confirman el aumento de la eficacia de la TFDA tras utilizar FS-PAA-NPs. En base atodo lo expuesto, se planteó el desarrollo de cinco sistemas nuevos de vehiculización de NRBr y AzBBrbasados en NPs-PAA de diferente composición. Con posterioridad, se evaluó la actividadantimicrobiana frente a cepas de S. aureus ATCC 43300 resistente a meticilina (MRSA) y E. coli(Gualdesi MS et al, 2021; Gualdesi MS et al, 2020; Gualdesi MS et al, 2019).Página 2 de 4METODOLOGÍA: La evaluación de la fotoactividad de los FS se realizó mediante el desarrollo deensayos de cinética de muerte, empleando MRSA y E. coli (inóculo estandarizado ~106 UnidadesFormadoras de colonias/mL (UFC/mL)). Los FS se solubilizaron inicialmente en una mezcla dedimetilformamida: solución acuosa (1:9) v/v y posteriormente se diluyeron con buffer fosfato salino(PBS, pH=7,4), con la finalidad de evaluar la acción como fotoantimicrobianos. Se emplearon diversasconcentraciones de FS y NPs de PAA (15 y 25 μM para AzBBr y NRBr, respectivamente, para el casode MRSA) y 120 μM para AzBBr frente a E. coli. Estas suspensiones fueron irradiadas durante 15 y/o 30min (dosis total de luz: 7,6 y 15,1 J/cm2, respectivamente) o incubadas en oscuridad. Luego de lostratamientos, se realizaron las diluciones necesarias y una microgota (10 μL) de cada dilución fuesembrada en Agar Tripteína Soya por triplicado e incubadas por 18-24 h a 37°C, para realizar elrecuento de UFC/mL. Los datos obtenidos, se compararon con los cultivos controles. Todos los ensayosincluyeron determinaciones en ausencia de FS, con y sin irradiación (a fin de evaluar si la luzdesencadena un efecto nocivo) y controles con FS conservados en oscuridad (para establecer si loscompuestos ejercen un efecto tóxico sin irradiación). Los datos se informaron como el promedio detodos los valores obtenidos.RESULTADOS: La eficacia fotodinámica de los nuevos nanofotosensibilizadores se probó frente a MRSA(Figura 1A y 1B), como modelo de las bacterias Gram-positivas. Como puede observarse en la Figura1A, a los 15 min de irradiación se evidenciaron pequeños cambios entre el FS libre y losnanofotosensibilizadores. En este contexto, se destacan las NPs 3, NPs 4 y NPs 5, que produjeron unacaída de 0,7 Log (UFC/mL) respecto al FS libre. Por otro lado, es importante resaltar que, al aumentarel tiempo de irradiación (30 min), todos los nanofotosensibilizadores erradicaron MRSA, mientras queFS libre, sólo provocó una inhibición del crecimiento bacteriano de 2,46 Log (UFC/mL). La Figura 1Bpresenta los resultados obtenidos para la inactivación fotodinámica de NRBr, utilizando unaconcentración de FS 25 μM. A los 15 min de irradiación, no hubo evidencia de actividad fototóxicapara el FS libre en solución acuosa o encapsulado en NPs 1, NPs 2 y NPs 3. Sin embargo, NPs 4 y NPs 5causaron una disminución de 0,63 Log (UFC/ml) y 1,44 Log (UFC/ml), respectivamente. El aumento dela dosis de luz (30 min de irradiación) desencadenó un marcado aumento de la capacidadfototóxica de la mayoría de los nanofotosensibilizadores. En estas condiciones, todos losfotosensibilizadores de tercera generación mostraron mayor actividad frente a MRSA que NRBr libre.Se destaca la eficacia antibacteriana de NPs 3, NPs 4 y NPs 5, que lograron erradicar estemicroorganismo.Para evaluar la inactivación fotodinámica de las NPs cargadas con AzBBr frente a bacterias Gramnegativas,se ensayó la capacidad fototóxica de los nuevos nanofotosensibilizadores utilizando E. coli.En comparación con las bacterias Gram-positivas, las bacterias Gram-negativas son menos sensiblesa la TFDA debido a la estructura más compleja de su pared celular, que es una barrera protectorapara muchos compuestos antimicrobianos, incluido el FS. (Meerovich GA et al, 2021) Por esta razón,fue necesario utilizar una concentración de 120 μM de AzBBr y 30 min de irradiación para poder lograrun efecto fototóxico frente a E. coli. La figura 1C muestra que las NPs 1, NPs 4 y NPs 5, potenciaron laactividad antimicrobiana del FS libre frente a E. coli. El primer sistema produjo una caída cercana a 1Log (UFC/mL), mientras que los dos últimos inhibieron completamente el crecimiento bacteriano bajolas condiciones ensayadas.Página 3 de 4** *0.002.004.006.0030Log (UFC/mL)Tiempo irradiación (min)ControlAzBBrAzBBr-PAA:NIPA 90:10AzBBr-PAA:NIPA 70:30AzBBr-PAA:NIPA 50:50AzBBr-PAA:NIPA 30:70AzBBr-PAA:NIPA 10:901A) 1B)1C)CONCLUSIONES: De acuerdo a los resultados obtenidos es posible afirmar que, la evaluación de estosFS de tercera generación frente a las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, permitió concluirque todos los sistemas de NPs de PAA son capaces de mejorar la actividad antimicrobiana de los FSde segunda generación. Esto supone un prometedor sistema de vehiculización de fármacos conpotencial aplicación en determinadas terapias relativas a patologías infecciosas producidas porestos microorganismos.REFERENCIASGualdesi MS, Vara J, Aiassa V, Alvarez Igarzabal CI, Ortiz, CS. (2021). New poly(acrylamide)nanoparticles in the development of third generation photosensitizers. Dyes and Pigments.,184:108856.Gualdesi MS, Vara J, Aiassa V, Alvarez Igarzabal CI, Ortiz CS. (2020). Thionine in the design of newphotosensitizers: Bromination and vehiculization in polymeric nanoparticles. J Mol Liq., 310:113247.Gualdesi MS, Vara J, Pereyra L, Ortiz CS. (2019). Halogenated phenotiazine as photoantimicrobialagent against Staphylococcus aureus. Evaluation of the vehiculization in polymeric nanoparticles.Dyes and Pigments., 170: 107625.Meerovich GA, Akhlyustina EV, Denisov DS, Kholina EG, Makarova EA, ALukyanets E, Loschenov VB,Strakhovskaya MG. (2021). Photodynamic inactivation of Escherichia coli bacteria by cationicphotosensitizers. Laser Phys Lett., 18:115601.Página 4 de 4Montes de Oca MN, Vara J, Milla L, Rivarola V, Ortiz CS. (2013). Physicochemical properties andphotodynamic activity of novel derivatives of triarlylmethane and thiazine. Arch Pharm Chem Life Sci.,346:255.Urrutia MN, Ortiz CS. (2013). Spectroscopic characterization and aggregation of azine compounds indifferent media. Chem Physics., 412:41.