Optimización de técnicas de PCR para la detección de los microsporidios Encephalitozoon hellem, E. intestinalis y E. cuniculi en muestras de materia fecal

MENA C; SILVA DE ARAÚJO R; BURSTEIN VL; GUASCONI L; BECCACECE I; ALMEIDA M; BOSSIO S; BARNES AA; CERVI L; LALLO MA; CHIAPELLO LS

Otro; XXXIII Reunión Anual SAP; 2022

Los microsporidios son patógenos oportunistas en individuos inmunocomprometidos, causando diarrea crónica e infecciones diseminadas. Previamente, hemos estandarizado una Nested PCR para la detección de Enterocytozoon bieneusi en heces, la especie más frecuentemente aislada. Sin embargo, especies de Enterocytozoon también pueden causar síndrome debilitante.El objetivo de este trabajo fue evaluar diferentes técnicas de PCR para la detección de Encephalitozoon intestinalis, E. hellem y E. cuniculi en cultivos celulares infectados con esporas y en muestras de materia fecal (MF).Se realizaron infecciones de la línea celular RK13 con esporas de E.intestinalis, E. hellem o E. cuniculi. Las células infectadas fueron lisadas y las esporas se detectaron por coloración Tricrómica de Weber. La extracción de ADN se realizó de esporas provenientes de cultivo y de MF de individuos sanos previamente inoculadas con esporas. Se evaluó el rendimiento y calidad de ADN (NanoDrop?, Themofisher) de diferentes técnicas de extracción utilizando dos kits comerciales (Qiagen®/Productos Biológicos®), siguiendo los protocolos de los fabricantes o realizando modificaciones. Se evaluó una PCR dirigida contra el ADN ribosomal de varios géneros de microsporidios (PCR panmicrosporidia) y una PCR con primers específicos para E. intestinalis.El mejor rendimiento y calidad de ADN se obtuvo con el kit Qiagen, con modificaciones en incubación a 65°C previo a la lisis y ruptura mecánica con perlas de vidrio. La PCR panmicrosporidia fue eficiente en amplificar una banda de 1200-1300pb (específica de microsporidios) a partir de ADN de los cultivosinfectados y de las heces inoculadas con E. hellem y E. cuniculi. Se obtuvo amplificación de un producto de 930pb específico de E. intestinalis utilizando una PCR especifica a partir de cultivos celulares. Estos resultados demuestran que ambas PCR son buenas candidatas para continuar en su optimización para aplicación en el diagnóstico de microsporidiosis.