El uso de técnicas sintéticas para la producción de péptidos y proteínas pequeñas permite sintetizar péptidos naturales que son difíciles de expresar en bacterias, incorporar aminoácidos no naturales o realizar modificaciones en el esqueleto del péptido o la proteína. La técnica más usada para este propósito es la de síntesis en fase sólida, en la cual la cadena peptídica se polimeriza unida a una superficie sólida. Durante esta síntesis, se utiliza ácido trifluoroacético (TFA) para cortar la cadena peptídica de la superficie y para purificar al péptido. La estructura tridimensional de los péptidos se determina espectroscópicamente, especialmente utilizando infrarrojo (IR) y dicroísmo circular (CD). Para la determinación de estructura secundaria mediante IR, se analiza la posición de la banda amida I correspondiente al estiramiento del C=O del enlace peptídico que aparece entre 1600 y 1700 cm-1, prácticamente en el mismo intervalo de frecuencia en el que aparece la vibración de los enlaces H-O-H del agua. Por esta razón, una manera adecuada de hacer determinaciones de IR de péptidos y proteínas en solución acuosa es utilizar ATR, en el cual el paso óptico de la luz es muy pequeño (~mm) y se puede descontar correctamente la contribución del agua. Por otra parte, la presencia de trazas de TFA en péptido sintéticos también contribuye en esta región debido a la vibración del grupo COO-, lo cual ha llevado a concluir en diversos trabajos publicados que estos péptidos sintéticos no pueden analizarse por IR (1).
El objetivo de este trabajo, es estudiar distintas estrategias para analizar espectros de IR de péptidos sintéticos, particularmente el modo de descontar la contribución del agua y del TFA. El estudio se realizó con un aminoácido (histidina) con el agregado de TFA como sistema modelo y con un péptido sintético (hexahistidina). Este péptido tiene un 96.6% de pureza, y las impurezas están principalmente constituidas por sales de trifluoroacetato. Se realizaron espectros de infrarrojo a soluciones de buffer, histidina, histidina con TFA, TFA y hexahistidina, en función del pH y la concentración. El mejor análisis espectral se logra cuando se descuenta primero la contribución del agua de los espectros de TFA y hexahistidina para luego restar el correspondiente espectro de TFA. Con esta estrategia es posible obtener espectros de hexahistidina en las distintas condiciones estudiadas, cuyas bandas corresponden a las distintas frecuencias asignadas a los grupos funcionales del péptido.
Referencias:
Agradecimientos:
Los autores agradecen a FONCyT, SECyT, y CONICET por el apoyo económico. LEV agradece a CONICET por la beca otorgada.
