Detección de endotoxinas en la elaboración de liposomas mediante ensayo de lisado de amebocito de limulus (LAL)

Congreso; 1er Congreso Nacional de Ciencia Reguladora ANMAT; 2019

La aplicación de la nanotecnología ha permitido vehiculizar principios activos (PA) hidrofóbicos, mejorando su biodisponibilidad e incluso disminuyendo su toxicidad. Actualmente, entre las nanoformulaciones de PA, los liposomas son las más comunes en el mercado. Estos son administrados por vía parenteral, por lo cual el límite de endotoxinas en los mismos está regulado. Por otro lado, las endotoxinas podrían interaccionar con los liposomas y/o sus componentes debido a su naturaleza anfipática. En este trabajo, se evaluó la detección de endotoxinas durante la elaboración de liposomas conteniendo doxorrubicina, mediante el ensayo Lisado de amebocito de limulus (LAL). Se elaboraron liposomas [colesterol (Col) : diestearoil fosfoetanolamina-metoxipolietilen glicol 2000 (PE) : fosfatidil colina hidrogenada de soja (PC); (38:7:55 mol)] de ~100 nm determinado a través de dispersión dinámica de luz (DLS), mediante ciclos de ultrasonido - vortex, en presencia de endotoxina estándar de control (EEC) en la etapa de solubilización de los lípidos. Se determinaron las EEC mediante el ensayo LAL cromogénico de punto final en estos liposomas sin doxorrubicina; como así también en el producto final, liposomas comerciales conteniendo doxorrubicina. Primeramente, se observó que EEC añadidas al producto final, son detectadas; mientras que añadidas en la etapa de solubilización de los lípidos, no son detectadas; incluso solubilizando los liposomas con 0,25 - 0,5% del detergente C12E10. Además, se observó que EEC agregadas a las muestras de cada uno de los lípidos en agua, son detectadas. Sin embargo, si dichos lípidos son solubilizados con EEC en isopropanol, secados por vacío y finalmente resuspendidos en agua, las EEC son detectadas solo en las muestras de PE y PC. Aunque, si se preparan muestras de Col, junto con PE o PC en una relación molar 40:60 o 10:90 [Col:PE/PC], son detectadas. No obstante, si bien es posible observar la reacción de EEC con LAL, tanto la muestra Col:PE (40:60) como todas aquellas conteniendo PC, interfieren en la medición de absorbancia (altas absorbancias iniciales). Asimismo, se observó que en presencia de PC, las EEC reaccionan con una cinética diferente respecto a EEC en agua. Estos resultados indican que el procedimiento usado en medicamentos tradicionales para el ensayo LAL, podría no ser suficiente para la detección confiable de endotoxinas en nanoformulados liposomales. Consideraciones particulares deberían ser establecidas caso por caso.