Nanovesículas lipídicas de respuesta dual funcionalizadas con AuNPs como portadoras de doxorubicina: Herramientas de calidad por diseño para optimizar su obtención y evaluación de su utilidad en nanomedicina del cáncer.

TORRES, JAZMIN; CALDERÓN-MONTAÑO, JOSÉ; PRIETO-DAPENA, FRANCISCO; LÓPEZ-LÁZARO, MIGUEL; LONGHI, MARCELA; RUEDA, MANUELA; RABASCO, ANTONIO; GARCÍA, MÓNICA C*; GONZÁLEZ-RODRÍGUEZ, MARÍA LUISA*

Madrid

Congreso; XVI Congreso Sociedad Española de Farmacia Industrial y Galénica (SEFIG).; 2023

1.- Introducción. Entre los transportadores de base lipídica, las nanovesículas o liposomas (L) se han convertido en una de las herramientas más útiles para la administración de fármacos en el campo de la nanomedicina debido a su alta biocompatibilidad [1]. Recientemente, se han estudiado nanomateriales híbridos orgánicos/inorgánicos como plataformas prometedoras para aplicaciones terapéuticas, entre ellos, nanoportadores híbridos termo-sensibles para optimizar la farmacoterapia del cáncer [2].En estudios previos, se obtuvieron L cargados con doxorubicina (Dox) y funcionalizados con nanopartículas de oro (AuNPs-L-Dox) [1]. En este trabajo, para evaluar su desempeño como sistemas portadores, se propuso aplicar herramientas de calidad por diseño (QbD) para racionalizar el diseño experimental para funcionalizar los L-Dox con AuNPs. Tras la optimización, se evaluaron las propiedades de liberación de Dox desde estos sistemas y su utilidad en terapia de hipertermia óptica en nanomedicina del cáncer. 2.- Materiales y métodos. 2.1.- Preparación de L, encapsulación de Dox y funcioanalización con AuNPs. Se utilizaron los métodos de re-hidratación del film lipídico y gradiente de pH transmembrana para obtener L formados por 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina, colesterol y bromuro de dimetil-dioctadecilamonio (DDAB), y para encapsular Dox, respectivamente [1]. Se utilizó un diseño de Taguchi (L9) para evaluar diferentes variables: relación L-Dox:AuNPs y condiciones de anclado (tiempo de agitación, temperatura y periodo post-funcionalización) para optimizar la funcionalización. Los datos obtenidos se analizaron matemática y estadísticamente, utilizando el software DOEpack 2000. 2.3.- Estudios de caracterización. 2.3.1.- Tamaño y potencial electrocinético. El diámetro hidrodinámico (dH), índice de polidispersión (PDI) y potencial electrocinético (ζ) de los sistemas obtenidos se analizaron mediante dispersión de luz dinámica y electroforética, respectivamente (equipo Zetasizer Nano-S).2.3.2.- Eficiencia de encapsulación Dox (%EE). La %EE de Dox se determinó mediante HPLC (Hitachi® La Chrom Elite) tras lisis de los L-Dox con Tritón X-100.2.3.3.- Absorción en el espectro UV-Visible. Los espectros de absorción UV-vis de L, Dox y AuNPs, y de las mezclas de L-Dox con diferentes proporciones de AuNPs se registraron en un espectrofotómetro UV-visible (Agilent 8453). Las posiciones de las posibles bandas de absorción solapadas se determinaron a partir de la 2° derivada.2.4- Estudios de liberación in vitro. Los sistemas AuNPs-L-Dox se sometieron a análisis de liberación de Dox y se compararon con una muestra de referencia de Dox pura. Los estudios se realizaron en celdas bicompartimentales de Franz, utilizando diferentes medios biorrelevantes (pH 7,4 y 5,1 a temperatura fisiológica e hipertermia inducida por irradiación IR). 2.5- Estudios en cultivos celulares. Se analizó la viabilidad celular de células normales de queratinocitos (HaCaT) y células de cáncer de ovario (SK-OV-3) y de mama (MDA-MB-231) tratadas con las nanovesículas o Dox pura a diferentes concentraciones y durante distintos tiempos, en presencia y ausencia de irradiación, utilizando el método de resazurina. 3.- Resultados y Discusión. Los sistemas L-Dox exhibieron tamaños nanométricos (355 nm), PDI aceptables (<0,46) y ζ positivo (14 mV) debido a la presencia de DDAB en la bicapa lipídica. La superficie catiónica de los L-Dox permitió la funcionalización por interacción electrostática con AuNPs cargadas negativamente. A partir del QbD, se observó que la relación L-Dox:AuNPs, el tiempo de agitación y la temperatura afectaron significativamente las propiedades de los AuNPs-L-Dox. Tamaños nanométricos (516 nm), PDI aceptables (<0,4), ζ positivo (9,85 mV) y %EE= 80 ± 2 % se lograron con una relación L-Dox:AuNPs 8:3 (v/v), 3 min de agitación y 42 °C durante el anclaje. Los espectros de absorción UV-vis obtenidos para diferentes proporciones de AuNPs ancladas sobre L-Dox no mostraron diferencias en cuanto a la posición de las bandas de absorción respecto de los espectros de los componentes independientes, salvo en el caso de la banda de absorción de las AuNPs, que se desplazó desde 525 nm hasta 610-620 nm para AuNPs puras o ancladas sobre los L-Dox, respectivamente, lo que sugiere la existencia de agregación de AuNPs.Se controló la liberación de Dox hacia ambos medios receptores y se observó que, en condiciones de hipertermia óptica, se activó la liberación de Dox, lo que confirmó el comportamiento termo-sensible de los AuNPs-L-Dox. El medio ácido también promovió la liberación de Dox, demostrando así la respuesta pH-sensible de AuNPs-L-Dox.Los estudios en células SK-OV-3 y MDA-MB-231 mostraron que los AuNPs-L-Dox exhibieron actividad antitumoral concentración-dependiente y, en el caso de las células de cáncer de ovario, la irradiación incrementó el efecto de los sistemas, lo que demuestra su utilidad en terapias de hipertermia óptica en nanomedicina del cáncer. La viabilidad celular de los queratinocitos fue similar tras el tratamiento con Dox o AuNPs-L-Dox, lo que sugiere que los sistemas no incrementan la citotoxicidad.4.- Conclusiones. La herramienta de QbD permitió evaluar diferentes parámetros para optimizar el proceso la funcionalización de los L-Dox con AuNPs y se obtuvieron las nanovesículas portadoras AuNPs-L-Dox. Estos sistemas presentaron respuesta dual pH/fototermo-sensible para controlar la liberación de Dox lo que demuestra su utilidad en terapias de hipertermia óptica y expone un beneficio para su aplicación en la nanomedicina del cáncer.5.- Agradecimientos. Los autores agradecen al CONICET y a la Universidad Nacional de Córdoba (UNC), Argentina. También agradecen al Ministerio de Ciencia e Innovación de España, a la Junta de Andalucía, al VI Plan Propio de la Universidad de Sevilla, a la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica-Fondo para la investigación Científica y Tecnológica, y a la Secretaría de Ciencia y Tecnología-UNC por el financiamiento, y al CITIUS, España