Producción de Factor IX humano recombinante (FIXr) en células de mamífero

ARIAS, C.; CORONA, D.; MARTINEZ, H.D.; ARGARAÑA C.; BOCCO, J.L.; DANIOTTI, J.L.; VITALI, S.; MASSA, C.

Buenos Aires

Simposio; SIMPOSIO ARGENTINO DE BIOPROCESOS (SAPROBIO); 2016

SIMPOSIO ARGENTINO DE BIOPROCESOS

INTRODUCCIÓNEl tratamiento de la Hemofilia B se basa en la administración de concentrados de FIX por vía endovenosa, tradicionalmente de origen plasmático humano. En la actualidad no existe producción a nivel nacional de un biofármaco recombinante de FIX, y solo se encuentra en el mercado local un medicamento de origen extranjero. El objetivo principal de este trabajo de investigación fue generar una línea celular que exprese de manera estable FIXr en forma activa.METODOLOGÍASe diseñaron vectores plasmídicos de expresión que poseen las secuencias del gen que codifica para el FIXr y para la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de la DHFR se utilizó para la correcta selección clonal y/o amplificación del número de copias del gen del FIXr en el genoma de la célula modelo con el agregado de niveles crecientes de metotrexato (MTX). Se generaron líneas estables mediante transfección en medio de cultivo carente de timidina e hipoxantina. Se realizó el screening de aproximadamente 100 clones a fin de seleccionar aquellos que poseían mayores niveles de expresión de FIXr activo y total. Aquellos que presentaron considerables niveles de expresión fueron tratados con concentraciones crecientes de MTX agregado en el medio de cultivo (Fig.1). A partir de las poblaciones celulares que poseían mayores niveles de expresión de FIXr activo se generaron clones únicos. Los clones se adaptaron a la suspensión mediante deprivación gradual de Suero Fetal Bovino (SFB) hasta su total eliminación (Fig.2).Se caracterizó el clon C3/G10 adaptado al crecimiento en suspensión libre de suero mediante: presencia del gen del FIXh en el genoma celular por PCR de punto final (Fig.3), presencia del transcripto correspondiente mediante la generación de cDNA por transcripción reversa con primer específicos y posterior PCR de punto final (Fig. 4), presencia de FIX intracelular por Western Blot (Fig. 5), FIX activo en sobrenadante de cultivo por coagulometría (Fig. 6), FIXr total por ELISA (Fig. 6) y por último la presencia y perfil de expresión de FIXr mediante HPLC (Fig. 7).CONCLUSIONESSe logró obtener una línea celular estable productora de FIXr con actividad biológica a partir de cultivos en suspensión y en alta densidad celular libre de proteínas de origen animal como lo requiere la autoridad sanitaria.Estos son resultados promisorios en vista al desarrollo de un biofármaco recombinante para el tratamiento de la Hemofilia B a producirse en un laboratorio público facilitando la accesibilidad al mismo.