Estres oxidativo en bacterias: Posible mecanismo de acción de Nanopartículas de plata como antimicrobianos.

MELISA A QUINTEROS; VIVIANA CANO ARISTIZÁBAL; DALMASSO PABLO; PAULINA L PÁEZ

Rosario, Santa Fe

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología, XIV Congreso Argentino de Microbiología 2016; 2016

Asociación Argentina de Microbiología (aam), Asociación Latinoamericana de Microbiología (ALAM)

RESUMEN APROBADOINTRODUCCION Y OBJETIVOSLos patógenos resistentes a antibióticos suponen una amenaza para el tratamiento de una amplia gama de infecciones graves y han demostrado tener una gran capacidad para desarrollar mecanismos de resistencia, a menudo transferibles, contra prácticamente todos los antibióticos de uso clínico [1]. La aparición de cepas bacterianas resistentes a muchos antibióticos usados actualmente acentúa cada vez más la necesidad de encontrar nuevos enfoques para el tratamiento de las infecciones. Por otro lado es cada vez más común escuchar los términos nanotecnología, nanomateriales, nanopartículas, etc., por lo que resulta innegable el impacto que el estudio de la Nanociencia está teniendo en los diferentes ámbitos sociales, culturales y económicos de nuestra vida diaria [2]. Las nanopartículas de plata (NPsAg) han demostrado ser eficaces contra las bacterias resistentes a los antibióticos y sus propiedades antimicrobianas se le atribuyen a su alta reactividad con las proteínas, a los cambios estructurales que producen en la pared celular y en la membrana, lo que resulta en la inhibición y la muerte celular. Además se les asigna una alta reactividad debido a que producen la inhibición de la replicación del ADN bacteriano [3-4]. Otra posibilidad es que podrían causar una rápida generación de radicales libres a través de reacciones redox en las que reaccionan con el oxígeno o el agua libre y con el Fe2+, generando especies reactivas de oxígeno (ERO) a través de la reacción de Fenton [5]. Las altas concentraciones de ERO en la célula pueden resultar en la generación de estrés oxidativo [6, 7]. El estrés oxidativo es una condición producida por las altas concentraciones intracelulares de ERO, las cuales las células microbianas son incapaces de neutralizar [8, 9]. Las especies reactivas del oxígeno incluyen radicales superóxido, radicales hidroxilo y peróxido de hidrógeno, entre otros; Estas especies se producen normalmente durante el metabolismo de procariotas y eucariotas, principalmente como un subproducto de la respiración aeróbica, pero su exceso puede deberse a otras fuentes extracelulares, tales como luz ultravioleta o metales de transición, incluyendo el mismo hierro. Las células sometidas a estrés oxidativo tienen diversas disfunciones en lípidos, proteínas y en el ADN, que se traducen en daños reversibles o irreversibles y que por lo tanto podrían resultar en la muerte de los microorganismos.El objetivo de este trabajo es contribuir a la comprensión del mecanismo de acción de nanopartículas de plata como generadores de daño oxidativo en diferentes géneros bacterianos mediante la evaluación de estrés oxidativo y nitrosativo.Sobre la base de los antecedentes expuestos, la hipótesis que consideramos es que las nanopartículas de plata podrían interactuar con la membrana bacteriana, alterando el metabolismo respiratorio, causando una rápida generación de radicales libres por reacciones redox, llevando a la célula a una condición de estrés oxidativo que conduciría a la muerte bacteriana. MATERIALES Y MÉTODOSLas nanopartículas de plata fueron obtenidas por biosíntesis extracelular a partir del sobrenadante del cultivo de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.El control de la síntesis se llevó a cabo por espectrofotometría Uv-Vis y por Microscopia de Transmision.La susceptibilidad a las nanopartículas biosintetizadas se determinó mediante el método de macrodilución en tubos, calculando la concentración mínima inhibitoria (CIM) y la concentración bactericida (CBM) conformes a las normas establecidas por el Clinical and Laboratory Standards Institute [10].Las cepas bacterianas estudiadas fueron Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.La generación de especies reactivas del oxígeno (ERO) producida por la acción de las nanopartículas fue determinada por espectrofluorometría y por microscopía de fluorescencia utilizando como monitor de ERO a la sonda H2-DCFDA. Esta sonda en presencia de ERO se oxida y emite fluorescencia. Los resultados se expresaron respecto al control sin nanopartículas.La cuantificación de las especies intermedias de nitrógeno (EIN) se realizó mediante la reacción de la Griess. El óxido nítrico (ON) se convierte rápidamente en nitrito en soluciones acuosas y, por lo tanto, el total de nitrito se puede utilizar como un indicador de la concentración de ON. Este se midió espectrofotométricamente a 540 nm. Los resultados se expresaron respecto al control sin nanopartículas.RESULTADOSLas nanopartículas biosintetizadas exhibieron un pico de absorción alrededor de 390 nm, característico del plasmón de superficie asociado a nanopartículas de plata. La Microscopia de Transmision confirmo que presentaban un tamaño de alrededor de 30 nm y de forma tipo esferoidal.Los ensayos de susceptibilidad confirmaron la actividad antimicrobiana de las nanopartículas biosintetizadas frente a las cepas estudiadas. La CIM y la CBM determinadas se encontraban entre 0,016-0,203 pM.La generación de especies reactivas del oxígeno inducida por las nanopartículas de plata biosintetizadas fue tiempo y concentración dependiente en las tres especies bacterianas estudiadas. Se observó el aumento de la producción de ERO en S. aureus después de 1 h de incubación con NPsAg. En E. coli la generación de ERO fue dependiente del tiempo con la estimulación máxima observada a las 4 horas de incubación con NPsAg. El máximo aumento de ERO en P. aeruginosa fue observado a las 3 horas de incubación con las nanopartículas de plata. Estos resultados fueron confirmados por microscopía de fluorescencia.De manera similar a la determinación de la producción de ERO, los niveles de EIN fueron tiempo y concentración dependientes de las nanopartículas de plata. En S. aureus se obtuvo el estímulo máximo después de 2 h mientras que la generación de EIN en E. coli fue menor en este momento de la incubación con las nanopartículas. En P. aeruginosa, los valores EIN disminuyeron con el tiempo un 20% hasta 2 hs y luego se mantienen constantes.Hemos demostrado que las nanopartículas de plata biosintetizadas generan estrés oxidativo en Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa mediado por el aumento de las especies reactivas del oxígeno y este aumento esta correlacionado con su actividad antimicrobiana. Por otra parte, hemos demostrado que el estrés oxidativo causado por las NPsAg biosintetizadas se asoció a una variación en el nivel de las especies intermediarias de nitrógeno (EIN).La formación de ERO y EIN por NPsAg puede ser considerada para explicar la muerte bacteriana.