Promotores constitutivos y regulables para sistemas de expresión en bacterias ácido lácticas

GARAY NOVILLO, J. N.; RUIZ MASÓ, J. A.; DEL SOLAR, G.; BARRA, J. L.

Madrid

Congreso; 13ª REUNIÓN DE LA RED ESPAÑOLA DE BACTERIAS LÁCTICAS; 2019

RedBAL

Introducción: Las Bacterias Ácido Lácticas (BAL), clasificadas como ?microorganismos seguros para su uso en producción alimenticia? por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA), representan prometedoras biofactorías para la producción más segura de proteínas recombinantes. Los sistemas de expresión en estas plataformas biotecnológicas son aún limitados, por lo que el desarrollo de vectores versátiles para expresión génica, ya sea regulada (limitada por la disponibilidad y acceso de un inductor), o constitutiva, es una necesidad actual.Objetivos: Con el fin de expandir las herramientas moleculares para la construcción de sistemas de expresión para BAL, se identificaron y clonaron en un vector de caracterización de promotores secuencias promotoras propias de Lactococcus lactis que funcionaran tanto en esta bacteria como en Escherichia coli. Mediante análisis in silico se detectaron posibles regiones reguladoras en las mismas, con el objetivo de modificarlas y generar así promotores constitutivos.Materiales y Métodos: La actividad promotora de regiones genómicas de L. lactis MG1363 (LLMG), clonadas en vectores que contienen la secuencia codificante de mCherry como reportero fluorescente (pTLGR y pRCR), se analizó inicialmente en E. coli para identificar promotores potencialmente regulados en L. lactis y regiones activas en ambos organismos, utilizando como referencia el promotor constitutivo de alta actividad P5N8 (Zhu D., et al., 2015). Usando la técnica de iPCR con oligonucleótidos divergentes fosforilados en el extremo 5?, se construyeron una batería de promotores mutantes. La actividad de los promotores silvestres y mutantes se analizó en LLMG y en una estirpe isogénica mutante de deleción en la secuencia codificante del regulador global CcpA (LLMGΔccpA) (Zomer A. L., et al. 2007), mediante detección y cuantificación de la fluorescencia emitida usando microscopía de fluorescencia y espectrofluorimetría en Varioskan, respectivamente.Resultados: Las regiones genómicas de LLMG denominadas PR1 y PG2, que corresponden a los promotores del gen de la subunidad IIAB del transportador PTSMan (ptnAB ?llmg_0729?) y al gen de la glicerol kinasa (glpK ?llmg_1099?) respectivamente, exhibieron actividad promotora fuerte en E. coli. Sin embargo, en LLMG solo PR1 presentó una actividad promotora mayor que el promotor de referencia P5N8, mientras que para la región PG2 no se detectó actividad alguna. El análisis in silico predijo estructuras secundarias del ARNm que dificultarían el acceso al SD y motivos cre de unión a CcpA downstream del sitio -44 del promotor, sugiriendo represión por catabolito. Mutantes de deleción que evitarían la formación de la estructura que secuestra el SD mostraron una mayor producción de mCherry. El análisis espectrofluorimétrico de la actividad de promotores silvestres y mutantes con secuencias aleatorias de los sitios cre en LLMGΔccpA demostraron que ambos promotores están bajo regulación por represión por catabolito y que la mutación de sus sitios cre anula dicha represión, aunque debido a su cercanía con los sitios de unión de la RNA polimerasa estas mutaciones perjudicaron significativamente la actividad promotora. Para PG2, la construcción de un mutante de deleción en la secuencia upstream del sitio -60 reveló que dicho promotor sufre una segunda regulación de naturaleza desconocida que presenta un efecto aditivo a la represión por catabolito.Conclusiones: La caracterización de estos nuevos promotores constitutivos fuertes y regulables puede ser de particular interés para investigación básica y/o aplicaciones industriales.