Combinando módulos para un marcaje fluorescente óptimo de bacterias lácticas usando replicones promiscuos de la familia de pMV158.

RUIZ MASÓ, J. A.; GARAY NOVILLO, J. N.; GARCIA, D.; BARRA, J. L.; DEL SOLAR, G.

Madrid

Congreso; 13ª REUNIÓN DE LA RED ESPAÑOLA DE BACTERIAS LÁCTICAS; 2019

RedBAL

El marcaje con proteínas fluorescentes permite el seguimiento de células bacterianas en estudios de formación de biopelículas, competición, supervivencia a condiciones de estrés e interacción con células eucariotas, realizados tanto in vivo como in vitro. Durante los últimos años se han desarrollado unos pocos vectores plasmídicos para el marcaje fluorescente de bacterias ácido-lácticas (BAL), un grupo heterogéneo que incluye microorganismos usados en la industria alimentaria, como probióticos, o como vectores vivos para la liberación de vacunas mucosas. Para un marcaje correcto y versátil de un amplio rango de BAL no sólo se requiere un vector que contenga un replicón promiscuo junto con un sistema robusto para la expresión regulada o constitutiva del determinante de fluorescencia, sino que también es clave el conocimiento de las principales características del conjunto plásmido/hospedador/proteína fluorescente. Mediante el uso de Lactococcus lactis como especie BAL modelo, hemos realizado un análisis comparativo de las propiedades de uso de una serie de vectores de marcaje construidos por la combinación de un replicón promiscuo (pMV158 o pSH71) de la familia de pMV158 con el gen codificante de la proteína fluorescente EGFP o mCherry, clonado bajo el control del promotor PX o del promotor PM, ambos pertenecientes al operón mal de neumococo, involucrado en el transporte y utilización de maltosacáridos. Algunos de los vectores que portan el promotor PM también incluyen el gen malR, cuyo producto reprime la transcripción a partir de este promotor, lo que permite la síntesis inducible por maltosa de las proteínas fluorescentes. En este trabajo hemos determinado el número de copias y la estabilidad segregacional de las distintas construcciones, así como el efecto de estas características en el fitness y en la intensidad de fluorescencia del hospedador lactocócico. Las construcciones basadas en el replicón de pSH71 tienen una mutación que les confiere un fenotipo de alto número de copias (~115) y son segregacionalmente estables. Por el contrario, el número de copias de los vectores basados en el replicón pMV158 es más bajo (~8-45) y varía sustancialmente dependiendo del contexto genético del plásmido y de las condiciones de crecimiento de la bacteria, lo que conlleva, en ocasiones, a una herencia menos estable. También observamos que la síntesis de las proteínas fluorescentes codificadas por estos plásmidos no produce una disminución significativa del fitness bacteriano. El uso de los sistemas de expresión inducibles nos permitió determinar que las proteínas fluorescentes EGFP y mCherry son muy estables en L. lactis. Asimismo, hemos establecido, por primera vez, las condiciones específicas para la cuantificación precisa de la fluorescencia emitida por estas bacterias en función de los tiempos de maduración de las proteínas fluorescentes. La determinación de estos parámetros puede resultar esencial para optimizar el uso de estos vectores en un huésped particular, evitar artefactos en la cuantificación de la fluorescencia emitida, y facilitar la elección del vector más adecuado para una aplicación concreta.