Producción de la enzima recombinante Lactato Oxidasa a escala de laboratorio

Simposio; 6º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos (SAPROBIO 2021); 2021

La enzima Lactato Oxidas (LOX) es ampliamente utilizada en la formulación de kits, biosensores y reactivos diagnósticos destinados a medir la concentración de lactato en muestras biológicas. El lactato es un biomarcador importante para el diagnóstico clínico. La concentración de lactato en sangre fuera del rango normal puede ser indicativa de acidosis láctica causada por hipoxia tisular u otras enfermedades subyacentes como enfermedades hepáticas, anemia o sepsis. En este trabajo, se propuso desarrollar el proceso biotecnológico a escala de laboratorio para la producción de la enzima LOX de Aerococcus viridans recombinante. Diseñamos un vector de expresión para sobreexpresar la LOX fusionada a una etiqueta de afinidad en Escherichia coli. En principio, con el objetivo de optimizar las condiciones de expresión se analizaron dos inductores, IPTG (0,4mM) o Lactosa (0,17% o 0,34%). La proteína fue sobreexpresada con ambos inductores y los niveles de expresión obtenidos con lactosa 0,34% fueron mayores a los obtenidos con IPTG, permitiendo el remplazo de este último por un inductor más económico como la lactosa. Posteriormente, la LOX recombinante fue purificada exitosamente mediante cromatografía de afinidad, obteniéndose aproximadamente 30-35 mg/L de cultivo, con un alto grado de pureza. Con la finalidad de caracterizar la LOX producida en nuestro laboratorio, analizamos la funcionalidad y estabilidad de la misma en el kit diagnóstico Lactate (cód. 1999795) de Wiener Laboratorios SAIC. Los ensayos fueron realizados utilizando la enzima LOX comercial provista por el kit como referencia. Los resultados obtenidos en el ensayo de funcionalidad mostraron que la reactividad del sistema utilizando la LOX producida en nuestro laboratorio es equivalente a la del kit comercial. En los ensayos de estabilidad (estabilidad acelerada a 37°C), se observó que la reactividad del kit utilizando la LOX producida en nuestro laboratorio fue comparable con la comercial hasta el día 10. Luego, la perdida de funcionalidad del kit formulado con nuestra LOX fue más acelerada que la del kit formulado con la proteína comercial. La pérdida de funcionalidad fue del 16,8% para la LOX recombinante y del 1,5% para la comercial luego de tres semanas de incubación. Finalmente, nos propusimos obtener un formulado a base de la enzima liofilizada. Se analizaron varias formulaciones conteniendo excipientes para estabilizar la proteína durante el proceso de liofilizado. Los excipientes analizados fueron diferentes azúcares en distintas concentraciones y en algunos casos, combinados con un polímero. Se midió la funcionalidad de la proteína antes y después del proceso de liofilizado. La funcionalidad permaneció prácticamente intacta en una de las formulaciones probadas luego de la liofilización. Además, se observó que luego de 5 meses de haberse liofilizado la proteína y habiéndose almacenado a -20 sin exposición a la luz, la funcionalidad de la proteína se mantuvo inalterable. Además, la formulación a base de la enzima liofilizada fue analizada por Wiener Laboratorios SAIC de acuerdo a sus propios parámetros de calidad mostrando resultados alentadores. En conclusión, la optimización de las condiciones de crecimiento, inducción, purificación y formulación nos permitió producir una enzima LOX funcional en nuestro laboratorio.