Cultivo celular de alta densidad para producir la enzima Lactato Oxidasa recombinante

Simposio; 2021 6º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos (SAPROBIO); 2021

Las técnicas de cultivo de alta densidad celular (HCDC) son de relevancia para la producción de proteínas recombinantes. La productividad global de una proteína recombinante depende tanto de la densidad celular como del rendimiento del producto celular específico. Los HCDCs permiten alcanzar altas concentraciones de biomasa maximizando la cantidad de producto en un volumen dado dentro de un tiempo determinado. El objetivo de este trabajo fue utilizar la tecnología de HCDC para producir en Escherichia coli la enzima Lactato Oxidasa (LOX) recombinante, la cual es ampliamente utilizada en la formulación de biosensores y kits de diagnóstico humano. Para llevar a cabo este objetivo, se realizó un cultivo en batch-alimentado utilizando un biorreactor con capacidad para 2 L de cultivo (BIOSTAT A, Sartorius). El procedimiento consistió en tres etapas: 1. Etapa batch: la cepa de E. coli productora de la LOX fue inoculada en el biorreactor a una densidad celular (DO600) de 0,1. El batch se realizó en medio mínimo M9 modificado con glucosa (10g/L) a 37°C durante 8,5 horas. 2. Etapa batch-alimentado: una vez que la glucosa en el medio de cultivo fue consumida, se suministró una solución de alimentación con glucosa (700g/L) a una tasa constante. Esta etapa fue realizada a 30 °C durante 12,5 horas. 3. Etapa de inducción: la expresión de LOX fue inducida con lactosa (0,34%) a 22°C durante 8 horas. Durante todo el proceso el pH fue controlado a 6,8 a través de la adición de soluciones de NH4OH al 25% (p / v) o H3PO4 3 M. Los niveles de oxígeno disuelto fueron controlados al 20% mediante el control tanto de la velocidad de agitación como del ingreso de aire. Se tomaron muestras del cultivo periódicamente, analizando la concentración de glucosa, la densidad celular (DO600) y el peso celular seco. La glucosa fue consumida completamente a las 8,5 horas de cultivo en batch lo que indicó el fin de la fase en sistema cerrado y el comienzo de la etapa de alimentación, etapa durante la cual la glucosa se mantuvo a una concentración menor que 1gr/L. En las etapas de batch y batch-alimentado la densidad celular aumentó exponencialmente. La disminución de la temperatura a 30°C en la etapa batch-alimentado permitió una disminución en la tasa de crecimiento con el fin de evitar limitaciones en el oxígeno disponible. Al finalizar el proceso, una biomasa final de 26 g/l (DO600=60) fue alcanzada. Luego de la inducción, se tomaron muestras cada 2 horas para analizar el nivel de expresión de proteína, alcanzando un valor de 290 mg/L luego de 8 horas post-inducción. Al finalizar el cultivo las células fueron cosechadas y la enzima LOX recombinante fue purificada mediante cromatografía de afinidad con un alto grado de pureza y en forma activa. En conclusión, se logró producir la enzima recombinante de uso diagnóstico LOX, realizando un cultivo en batch-alimentado llegando a densidades celulares considerables. Optimizando las condiciones tanto en las etapas de crecimiento como de inducción esperamos lograr mayores rendimientos de biomasa y de producto final.