MEDICIÓN DE LA PROGRESIÓN DE LA HORQUILLA DE REPLICACIÓN MEDIANTE ANÁLISIS DE MOLÉCULAS ÚNICAS DE ADN POR MICROSCOPIA CONFOCAL.

MANSILLA SF; SORIA G; SPERONI J; GOTTIFREDI V

Mar del Plata

Congreso; LIV Reunión de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC); 2009

SAIC

El proceso de replicación debe lidiar con un alto número de lesiones al ADN provocadas por el metabolismo celular o por agentes externos. Esto ocasionó que el proceso de replicación del ADN evolucione generando mecanismos de regulación de fi- delidad de síntesis y de tolerancia al daño. Normalmente las téc- nicas utilizadas para medir procesos de síntesis involucran la in- corporación de nucleótidos radioactivos o de análogos de bases. La restricción de estos métodos es que solo permiten medir sín- tesis de ADN a nivel cuantitativo de manera limitada. Resulta muy complejo por ejemplo medir variaciones sutiles en la progresión de la horquilla de replicación que involucran síntesis de pocas bases de ADN, como es el caso de procesos acoplados a fase S. Es por esto que recientemente se desarrollaron métodos de análisis de moléculas únicas de ADN que permiten visualizar cam- bios en la velocidad de avance de la horquilla de replicación. En nuestro laboratorio logramos poner a punto una técnica novedosa conocida como ?Fiber Assay?. Este ensayo consiste en la incor- poración secuencial de dos análogos de bases (Cldu e IdU) que son detectados diferencialmente por anticuerpos específicos. Lue- go mediante un proceso de extensión se separan moléculas úni- cas de ADN desplegadas donde la incorporación de cada análo- go se puede ?medir? separadamente por microscopia de alta re- solución. Estas incorporaciones se realizan en manera sucesiva en procesos de replicación normal o separadas por un evento de daño al ADN (por ej. irradiación UV). De esta manera es posible estimar en manera sensible variaciones en la progresión de la horquilla de replicación no solo en respuesta a un determinado agente genotóxico sino también en el estudio del efecto de una proteína particular (ej. un inhibidor de activad polimerasa).