ESTUDIO DEL MECANISMO CATALÍTICO DE ENZIMAS CARBOXILESTERASAS CON RELEVANCIA BIOFARMACÉUTICA

RIBONE, S. R.; QUEVEDO, M. A.

Ciudad de Guatemala

Simposio; SIMPOSIO IBEROAMERICANO COIFFA 2020; 2020

Universidad del Valle de Guatemala

INTRODUCCIÓN: La necesidad de racionalizar las posibles vías de metabolización/bioactivación (M/B) en el organismo de diferentes moléculas exógenos con potencial actividad farmacológica es de suma importancia para la química medicinal debido a: 1) alta tasa de M que sufren un gran número de candidatos a convertirse en fármacos (F), durante las etapas de desarrollo de los mismos, lo cual ocasiona el abandono de su desarrollo generando altos costos de producción; (Tsaioun, K., 2016) y 2) la B selectiva de profármacos (PF), generando el F responsable de la acción terapéutica deseada, en una sección particular del organismo. (Oda, S., 2015) Los mencionados procesos de M/B son llevados a cabo por diferentes tipos de enzimas, dentro de las cuales la familia de las Carboxilesterasas (CES) es reconocida como la responsable de la M y B de F y PF de uso clínico. (Hatfield, M.J., 2010; Ishikzuca, T., 2013; Fukami, T., 2015) Dentro de esta familia, centramos los estudios sobre uno de los subtipos más importantes: CES1. (Hatfield, M.J., 2010) Si bien se han reportado reglas generales sobre la especificidad estructural de los sustratos que metaboliza este subtipo de CES, lo detalles moleculares de esta especificidad aún son desconocidos. (Hatfield, M.J., 2010; Fukami, T., 2015) Un claro ejemplo de esto lo representan los acetatos de orto y para nitrofenilo (oNPA y pNPA, respectivamente, Fig. 1) que, a pesar de su similitud estructural, se ha reportado una gran diferencia en su afinidad y tasa de metabolización por CES1. (Hatfield, M.J., 2010) OBJETIVO: El presente trabajo se centra en la utilización de estudios híbridos QM/MM con el fin de dilucidar a nivel molecular la especificidad catalítica de CES1 por estos sustratos. Estos estudios resultan de gran interés para dilucidar las potenciales vías de metabolización de futuros candidatos a convertirse en F y permitirá el diseño de nuevos PF con bioactivación selectiva mediada por CES que presentan localizaciones tisulares particulares. METODOLOGÍA: Los métodos utilizados para la realización del presente trabajo pueden ser divididos en 3 etapas: 1- Docking molecular de los sustratos a las CES. Se procedió a realizar el docking molecular de ambos ésteres sobre el sitio catalítico de CES1 (pdbcode: 5A7F), utilizando el software DOCK6. (Brozell, S.R., 2012) 2- Dinámica molecular (DM) de los complejos sustrato-CES1. Los complejos obtenidos en el paso anterior fueron sometidos a procedimientos de simulaciones de DM, utilizando Amber18. (Case, D.A., 2018) Luego de realizar las correspondientes fases de minimización, calentamiento y equilibración, se realizó una fase de producción de 100ns a 298°K. Sobre esta última fase, se realizaron estudios para analizar el porcentaje de ocupancia de las interacciones por puente hidrógeno (PH) de los sustratos en el sitio catalítico de CES1 y cuantificar la energía libre de interacción sustrato-enzima, utilizando el esquema de solvente continuo MM/GBSA. (Miller, B.R., 2012) 3- Simulaciones híbridas QM/MM de los complejos sustrato-CES1. El sistema fue dividido en dos regiones. En la región QM se incluyeron todos los átomos cercanos al sitio catalítico: cadenas laterales de la triada catalítica, bolsillo oxianión y los sustratos en estudio, utilizando el campo de fuerza SCC-DFTB3. (Gaus, M., 2011) El resto de la enzima es descripta como la región MM, utilizando el campo de fuerza ff14SB. (Case, D.A., 2018) Se simuló la reacción de hidrólisis reportada, utilizando LCOD y la técnica de umbrela sampling, muestreando las coordenadas de reacción (ruptura y formación de enlaces) en 100 ventanas de 0,1 Å. Cabe aclarar que solo se estudió el primer paso de hidrólisis (alquilación), ya que el segundo paso (desalquilación) es el mismo para ambos ésteres, siendo el primero el único posible paso limitante de la reacción.RESULTADOS: 1- Docking molecular de los sustratos a las CES1. Luego de los procedimientos de docking molecular, ambos sustratos mostraron una conformación final similar en la cavidad catalítica de CES1. En ambos casos ubicaron el oxígeno carbonílico en el bolsillo oxianión, realizando interacciones de puente hidrógeno con los residuos Gly142, Gly143 y Ala222 (Fig. 2). En cuanto a la orientación, el resto nitrofenilo fue ubicado en la cavidad más accesible al solvente del sitio catalítico, mientras que el grupo acetato fue ubicado en la cavidad más profunda del mencionado sitio activo de CES1. 2- Dinámica molecular (DM) y análisis de los complejos sustrato-CES1. Con los complejos obtenidos en la etapa anterior se procedió a realizar procedimientos de DM. Los análisis de la energía libre de interacción entre los sustratos y CES1 mostraron que oNPA posee un ΔG de mayor interacción (ΔG int) que pNPA (-23,3 y -21,1 kcal/mol, respectivamente), lo cual está en relación con la información reportada para la afinidad de éstos esteres (Km), (Hatfield, M.J., 2010) donde oNPA tiene una mayor afinidad por CES1 que el pNPA (73 y 822 µM). Un análisis más detallado realizado sobre los porcentajes de ocupación de la interacción por puente de hidrógeno (PH) de los sustratos en el sitio catalítico de CES1 reveló que oNPA posee un mayor porcentaje de PH con los residuos del bolsillo oxianión que el pNPA. Esto se debe a que la presencia del grupo NO2 en posición orto impide que el ligando se desplace de esta posición inicial manteniendo así una mayor interacción con los residuos del sitio activo, lo cual se traduce en una mayor afinidad por CES1. 3- Simulaciones híbridas QM/MM de los complejos sustrato-CES1. A partir de las etapas de producción de las DM, se continuó con procedimientos de DM híbrida QM/MM. Luego de que el sistema híbrido demostró estabilidad energética, se comenzó con el estudio mecanístico de hidrólisis del sustrato. Las simulaciones generadas durante las etapas de producción de cada una de las 100 ventanas, fueron utilizadas para la confección del perfil de energía libre de reacción (PMF). A partir de los PMF se extrajo la energía libre de reacción (ΔGrea) para cada sustrato frente a CES1 (Fig. 3). Dicha información fue comparada con las constantes de hidrólisis (kcat) reportadas. (Hatfield, M.J., 2010) Se puede observar que el orden de los ΔGrea de los sustratos analizados frente a CES1 es consistente con sus respectivas kcat, ya que oNPA es más estable frente a CES1 que pNPA con un menor kcat (0,6 y 3,1 s-1, respectivamente) y un mayor ΔGrea (5,8 y 4,4 kcal/mol, respectivamente, Fig. 3). Realizando una observación detallada de las estructuras de los estados de transición (TS1) en los PMF obtenidos, se observó que debido a la presencia del grupo nitro en orto, el oNPA debe desplazarse hacia afuera de la cavidad para alcanzar la estructura del TS1, de manera de evitar un impedimento estérico con los residuos del bolsillo oxianión Gly142 y Gly143. Esto produce el alargamiento del PH con Gly142 durante el transcurso de la reacción (3,8Å), impactando negativamente en la estabilidad del TS1 de oNPA, ya que cuenta con solo 2 PH en comparación de los 3 PH presentes en el TS1 de pNPA.CONCLUSIONES. Luego de utilizar una combinación de estrategias de modelado molecular con el fin de dilucidar las diferencias reportadas de los ésteres oNPA y pNPA como sustratos frente a la metabolización por CES1, se pudo observar una alta correlación entre los parámetros experimentales publicados de Km y kcat y los obtenidos por las estrategias de modelado, ΔGint y ΔGrea, respectivamente. Dichas correlaciones halladas fueron relacionadas directamente, en ambos casos, con particularidades estructurales provenientes de la presencia del grupo nitro en el anillo del resto nitrofenilo de los respectivos ésteres. Cuando el mismo se ubica en posición orto, esto le infiere al derivado oNPA una mayor afinidad por los residuos que componen el sitio activo de CES1 y al mismo tiempo una mayor estabilidad frente a esta enzima, debido a la desestabilización estructural de su TS1. Todo esto en contraposición a las propiedades que le infiere su presencia en para en el derivado pNPA. Estos resultados son alentadores para continuar con el estudio de especificidad molecular de CES1, y otros subtipos de CES, por sustratos con diferentes características estructurales.