Introducción
Durante la campaña agrícola 1994/95 sedetectaron por primera vez en Argentina, frutos de maní con carbón,provenientes de la región centro-norte del área manisera de Córdoba. Estapatología es producida por el hongo Thecaphorafrezii, el cual actualmente se ha diseminado y la afección se registra entoda el área manisera de Córdoba, con incidencias y prevalencias variablesentre campañas y distintas regiones; aunque la severidad del problema engeneral es mayor en la región norte de la provincia.
Además de las grandes pérdidas económicas quecausa el carbón por T. frezii en todala cadena de comercialización del maní, partiendo desde el productor, esnecesario tener en cuenta que la ingesta de maní o de sus productos derivados contaminadoscon las esporas de dicho hongo, llamadas teliosporas, podrían causar efectostóxicos en el público consumidor, aunque en la actualidad disponemos deinformación toxicológica muy escasa que avale o descarte de plano estaaseveración. En estudios previos realizados por nuestro grupo de investigaciónse observó que el consumo subcrónico de maní infectado con T. frezii no afectó el perfil nutricional (peso y ganancia depeso), hematológico, bioquímico (función hepática y renal) ni histológico(análisis histopatológico de hígado, bazo, pulmón y riñón) de ratas Wistar. Sinembargo, debido a que la susceptibilidad o resistencia de distintas especies ala toxicidad de las teliosporas puede ser diferente, el objetivo del presentetrabajo fue evaluar la citotoxicidad de extractos de teliosporas en células humanascultivadas in vitro.
Materialesy Métodos
Se prepararon tres extractos de teliosporas conhexano (E-Hex), acetato de etilo (E-AcEt), y metanol (E-MeOH), a los fines deseparar los compuestos liposolubles, de polaridad intermedia, y los compuestosmás polares, respectivamente. Para esto se utilizaron teliosporas purificadas apartir de maní contaminado, cosechado en la campaña 2013-2014. Los extractos fueronevaporados a sequedad bajo corriente de nitrógeno, redisueltos endimetilsulfóxido (DMSO), esterilizados por filtración y conservados a 4 °Chasta su utilización.
El estudio se realizó en líneas celulareshumanas de origen hepático (HepG2) y de epitelio de colon (Caco-2), muyutilizadas en toxicología debido a que permiten evaluar los efectos citotóxicossobre los blancos de acción principales de toxinas que ingresan por vía oral. Lascélulas fueron sembradas en placas de 96 pocillos (104 células/pocillo)y cultivadas en medio de cultivo DMEM (enriquecido con 10 % de suero fetalbovino, 2 mM de glutamina y 50 μg/mL de gentamicina), al que se le adicionó distintasconcentraciones (0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 y 1 %) de E-Hex, E-AcEt, E-MeOH oDMSO, durante 48 h a 37 °C y 5 % de CO2.
La viabilidad celular se determinó por lahabilidad de las células para convertir bromuro de3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) en cristales de formazánpor medio de la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa. Brevemente, elmedio de cultivo se reemplazó por una solución de MTT (0,5 mg/mL) en DMEMenriquecido, que luego de una hora fue removida y el formazán fue solubilizado conDMSO. La intensidad del color (evaluada por espectrofotometría a 595 nm) esproporcional al formazán sintetizado y al número de células viables.
Resultadosy discusión
La viabilidad de las células Caco-2 y HepG2no fue significativamente afectadapor ninguna de las concentraciones de los extractos (E-MeOH, E-AcEt y E-Hex) deteliosporas estudiadas. Estos resultados estuvieron de acuerdo con estudiosprevios realizados en ratas Wistar alimentadas durante 180 días con manícontaminado con teliosporas, en los cuales no se observaron cambios en lahistología ni en la función hepática de las ratas.
Debido a que es conocido el efecto tóxicoinducido por DMSO en bacterias y células de origen animal o humano, el rango deconcentraciones utilizadas de este disolvente universal fue testeado en los dostipos de células estudiados para poder realizar una correcta interpretación delos resultados. El porcentaje de células viables en ambas líneas celulares fuesignificativamente reducido por DMSO en el rango 0,4 - 1 %, manteniéndose laviabilidad alrededor del 80 %. Este porcentaje es aceptable ya que para poderevaluar citotóxicidad es necesario tener al menos 70 - 80 % de células viables.
Conclusiones
Los extractos metanólicos, con acetato deetilo y con hexano, de teliosporas no producen efectos citotóxicos en el rango0,1 -1 %, en las líneas celulares humanas Caco-2 y HepG2.
En función de estos resultados, el rango deconcentraciones de los extractos de teliosporas evaluado es adecuado para realizarestudios toxicológicos.
Efectos de losextractos metanólico (E-MeOH), de acetato de etilo (E-AcEt), de hexano (E-Hex),y del vehículo (DMSO) sobre la viabilidad de las líneas celulares Caco-2 yHepG2.
Elgráfico muestra el promedio de tres experimentos independientes ± el errorestándar.
Letrasindican diferencias entre los tratamientos y el control correspondiente (bp ˂ 0,01; cp ˂ 0,001).
Financiación: Elpresente trabajo fue financiado por Fundación Maní Argentino, PICT 2013-0750 y SECyT-UNC.Mary V.S. y Otaiza S.N. son becarios CONICET. Arias S.L. es becaria SECyT-UNC.Theumer M.G. es investigador de CONICET.
