c-FOS INTERACCIONA FÍSICAMENTE Y ACTIVA ENZIMAS PARTICULARES DE LA VÍA DE SÍNTESIS DE POLIFOSFOINOSÍTIDOS

ANDRES M CARDOZO GIZZI; ADOLFO R. ALFONSO PECCHIO; BEATRIZ LEONOR CAPUTTO

Buenos Aires

Congreso; Segundo Congreso Argentino de Microscopía; 2012

Asociación Argentina de Microscopía

Evidencias previas nuestras han demostrado que la proteína c-Fos activa la síntesis de fosfolípidos mediante un mecanismo independiente de su actividad genómica como factor de transcripción tipo AP-1. Sin embargo, el mecanismo por el cual esta proteína estimula la síntesis de fosfolípidos es desconocido. Aquí, mostramos que la inducción de células quiescentes a reingresar al ciclo celular promueve un incremento en el marcado radioactivo de polifosfoinosítidos que depende de la expresión de c-Fos. El uso de un mRNA antisentido específico para c-Fos prácticamente anula el efecto del incremento del marcado radioactivo de fosfatidilinositol-fosfato y fosfatidilinositol-bifosfato. La vía de síntesis de fosfatidilinositol (PtdIns) y sus derivados fosforilados (PIP?s) se compone de tres etapas o pasos metabólicos. El primero de ellos, es la conversión del ácido fosfatídico a CDP-diacilglicerol (CDP-DAG), reacción catalizada por la enzima CDP-diacilglicerol sintasa (CDS), una enzimas integral de membrana altamente dependiente en la concentración de Mg+2. La segunda etapa es la conversión de CDP-DAG a PtdIns por la enzima fosfatidilinositol sintasa (PIS), una enzima de bajo peso molecular localizada en el retículo endoplásmico. La última de las enzimas pertenece a la familia de quinasas de PtdIns (PIKs) que fosforilan al OH del anillo de inositol en los posiciones 3,4 y 5. De las diferentes quinasas descriptas, Fosfatidilinositol 4-quinasa (PI4K) es la más abundante. Existen descriptas dos isoformas, PI4KIIα y PI4KIIβ. Investigamos entonces si la estimulación por c-Fos de la síntesis de fosfatidilinositol y sus derivados fosforilados es consecuencia de la activación de enzimas particulares de su vía de síntesis. Encontramos que en homogenatos de células NIH 3T3, c-Fos recombinante activa in vitro las actividades de CDS y PI4K, pero no a PIS [1]. Para establecer si el mecanismo molecular de la activación enzimática implica una interacción proteína-proteína, inicialmente utilizamos una aproximación bioquímica: ensayos de co-inmunoprecipitacion. Transfectando transientemente a células NIH para expresar CDS, PIS, PI4KIIα y PI4KIIβ marcadas con rótulos, se las inmunoprecipitó y se reveló para detectar la presencia de c-Fos en los inmunocomplejos. Encontramos que c-Fos coinmunoprecipita con CDS y PI4KIIα, pero no con PIS o PI4KIIβ. Para ir más allá, se continuó con una estrategia diferente, Microscopía FRET (transferencia de energía resonante fluorescente). Existen diversas opciones para medir el fenómeno de FRET. Aquí se utilizó una metodología basada en la intensidad llamada ?emisión sensibilizada?, muy sencilla de implementar en un microscopio de fluorescencia, sea esta confocal o no. Utilizando quimeras de fusión entre nuestras proteínas de interés y proteínas fluorescentes. El principio de la ?emisión sensibilizada? es que un donor fluorescente excitado, de darse las condiciones para la transferencia de energía, excitará de forma no radiativa a un aceptor fluorescente, con una eficiencia determinada. Dado que esta eficiencia depende fuertemente de la proximidad, los fluoróforos deben encontrarse a menos de 10 nm de distancia para que la transferencia de energía ocurra, distancia propia de una interacción proteína-proteína. Midiendo la emisión del aceptor al momento de excitar el donor, puede establecerse la ocurrencia o no de FRET [2]. En este estudio se utilizaron el par donor/aceptor de CFP/YFP, fusionadas a c-Fos y las enzimas bajo estudio. Se obtienen entre 30-50 imágenes para cada caso en el microscopio confocal. Luego, es necesario corregir las imágenes obtenidas debido al ?sangrado espectral? del donor en el canal del aceptor, así como la excitación directa del aceptor por la fuente de luz. El procesado de imágenes, junto el proceso de normalización la señal son los mayores obstáculos en la implementación de la metodología [3]. En la Figura 1A puede verse las imágenes obtenidas en el microscopio confocal Olympus FV-1000, con la fluorescencia obtenida en el canal para el donor y el aceptor, las quimeras fluorescentes de las proteínas de interés (panel izquierdo y central). En el panel derecho, se encuentra la foto de eficiencia de FRET, pseudocoloreada en una escala de azul a rojo. La pequeña barra blanca en el corner izquierdo corresponde a 5 µm. En la Figura 1B, se observa la cuantificación del fenómeno. CONCLUSIÓN: Estudios de co-inmunoprecipitación, y de microscopía FRET evidenciaron consistentemente una interacción física entre c-Fos y las enzimas que activa pero no así con aquellas cuya actividad no regula [1]. Ello sugiere que c-Fos específicamente modula a estas enzimas a través de una interacción física directa, para generar su efecto de incrementar la síntesis de polifosfoinosítidos.