Optimización de técnicas de PCR para la detección de los microsporidios Encephalitozoon hellem, E. intestinalis y E. cuniculi en muestras de materia fecal.

Jornada; XXXIII REUNIÓN ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE PROTOZOOLOGÍA; 2022

Los microsporidios son patógenos oportunistas en individuosinmunocomprometidos,causando diarrea crónica e infecciones diseminadas. Previamente, hemosestandarizado una PCR anidada para la detección de Enterocytozoon bieneusi enmateria fecal, la especie más frecuentemente aislada de pacientes con diarrea. Sin embargo, especies de Enterocytozoon sp. también pueden causar síndromedebilitante. El objetivo de este trabajo fue evaluar diferentes técnicas de PCR para la detección de Encephalitozoon intestinalis, E. hellem y E. cuniculi en cultivos celulares eucariotas infectados con esporas y en muestras de materia fecal (MF).Se realizaron infecciones de la línea celularRK13 (Rabbit Kidney)con esporas de E. intestinalis, E. hellem o E. cuniculi. Las células infectadas fueron lisadas y las esporas se detectaron por coloración Tricrómica de Weber. La extracción de ADN se realizó de esporas provenientes de cultivo y de MF de individuos sanos, fijadas con formol o sin fijar, previamente inoculadas con esporas. Se evaluó el rendimiento y calidad de ADN (NanoDrop?, Themofisher) de diferentes técnicas de extracción utilizando dos equipos comerciales (Qiagen®/Productos Biológicos®), siguiendo los protocolos de los fabricantes o realizando modificaciones. Se evaluó una PCR dirigida contra el ADN ribosomal de varios géneros y especies de microsporidios (PCR panmicrosporidia) y una PCR con primers específicos para E. intestinalis.El mejor rendimiento y calidad de ADN se obtuvo con el kit de Qiagen, conmodificaciones en la temperatura de incubación previa a la lisis y ruptura mecánica con perlas de vidrio y proteinasa K. La PCR panmicrosporidia fue eficiente en amplificar una banda de aproximadamente 1200-1300pb (específica de microsporidios) a partir de ADN de los cultivos infectados y de las materias fecales inoculadas con E. helleM y E.cuniculi. Se obtuvo amplificación de un producto de 930pb específico de E. intestinalis utilizando una PCR con los primers Eint F-Eint R a partir de cultivos celulares. Estos primeros resultados demuestran que ambas PCR son buenas candidatas para continuar en su optimización para aplicación en el diagnóstico de microsporidiosis.