Un sistema estreptocócico para la expresión constitutiva o inducible de genes, dos replicones promiscuos de la familia de pMV158, y dos proteínas fluorescentes: combinando módulos para un marcaje versátil de bacterias lácticas.

JAVIER NICOLÁS GARAY NOVILLO; DIEGO GARCÍA; JOSÉ ÁNGEL RUIZ MASÓ; JOSÉ LUIS BARRA; GLORIA DEL SOLAR

Sevilla, Instituto de la Grasa - CSIC

Congreso; 12ª Reunión de la Red Española de Bacterias Lácticas; 2018

Red Española de Bacterias Lácticas

Introducción: El marcaje de bacterias con proteínas fluorescentes tiene una gran variedad de aplicaciones, incluyendo la localización subcelular de proteínas de fusión y sus dianas, la detección de transferencia plasmídica horizontal, y la trazabilidad de las bacterias en estudios de persistencia y competición, así como en análisis interactómicos in vivo e in vitro. Durante los últimos años se ha desarrollado un limitado número de vectores plasmídicos para el marcaje fluorescente de determinadas bacterias lácticas (BAL), un grupo heterogéneo que incluye microorganismos empleados en la industria alimentaria, como probióticos, o como vectores vivos para la generación de vacunas. El marcaje exitoso y versátil de un amplio rango de BAL no sólo requiere un vector con un replicón promiscuo y un sistema de expresión ampliamente reconocido para la expresión constitutiva o inducible del determinante fluorescente, sino también el conocimiento de las principales características del conjunto plásmido/proteína fluorescente/hospedador en cada una de esas bacterias.Objetivos: Usando Lactococcus lactis MG1363 como cepa modelo de BAL nos proponemos analizar comparativamente las propiedades de un conjunto de vectores de marcaje que han sido construidos mediante la combinación de: uno de dos replicones promiscuos de la familia de pMV158 (pMV158 o pSH71), uno de los dos promotores divergentes (PX y PM) del sistema de regulación de la utilización de maltosacáridos en estreptococos, y las proteínas fluorescentes EGFP o mCherry. Materiales y Métodos: Se han analizado los vectores pLS1ROM, pLS1ROM-GFP y pLS1ROM-mCherry, diseñados, respectivamente, para la expresión inducible por maltosa del gen diana de elección, y de los genes que codifican la proteína GFP o mCherry. Asimismo, se han estudiado los plásmidos pMV158GFP, pRCRPX y pRCRPM, que permiten el marcaje constitutivo con fluorescencia verde o roja. Se ha estudiado el número de copias y la estabilidad segregacional de estas construcciones en L. lactis mediante qPCR. La fluorescencia emitida por las bacterias portadoras de los plásmidos en estudio ha sido analizada por microscopía de fluorescencia y cuantificada mediante un espectrofluorímetro Varioskan.Resultados: Las construcciones basadas en el replicón pSH71 tienen un elevado número de copias (~120), que se debería a una mutación en el gen que codifica el represor transcripcional del gen rep, y se heredan de forma estable. El número de copias de los vectores basados en el replicón de pMV158 fue más bajo (~5 - 45) y varía sustancialmente dependiendo del contexto genético del plásmido y de las condiciones de crecimiento bacterianas, conllevando en algunos casos una cierta inestabilidad plasmídica. También se analizaron las condiciones de máxima emisión de fluorescencia de las bacterias que portan estas construcciones. Finalmente, mediante el uso de las construcciones inducible, hemos determinado la vida media de las proteínas fluorescentes en esta cepa de L. lactis.