USO DE LA TRANSFERRINA COMO TRANSPOTADOR DE LOS COMPLEJOS DEL Cr(III) AL INTERIOR CELULAR. ESTUDIOS DE ASOCIACIÓN.
Judith Toneatto, Pablo F. García y Gerardo A. Argüello.
INFIQC, Dpto. de Fisicoquímica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba. Ciudad Universitaria, 5000 Córdoba. República Argentina.
e-mail: jtoneato@fcq.unc.edu.ar
1. INTRODUCCIÓN.
Nuestro interés se centra en el estudio de los complejos polipiridínicos del Cr(III) con compuestos de interés biológico y su potencial uso como fotosensibilizadores en Terapia Fotodinámica (PDT=PhotoDynamic Therapy). Estudios anteriores permitieron determinar que los complejos polipiridínicos de Cr(III) poseen atractivas propiedades, lo cual sugiere que podrían ser considerados como potenciales agentes fotosensibilizadores para el uso en terapia fotodinámica1.
Por otro lado, una característica de las células neoplásicas que las diferencian respecto de las células normales, es la sobre expresión de receptores de Transferrina (proteínas que presentan una gran variedad de funciones fisiológicas tal como el transporte, asociación, etc. 2,3) en la membrana plasmática4, señalando a esta proteína como posible transportador de sensibilizadores catiónicos al interior de las células neoplásicas.
En este trabajo presentamos los estudios realizados para caracterizar el proceso de asociación de los complejos [Cr(phen)2(dppz)]3+ y [Cr(phen)3]3+ frente a apo-Transferrina, haciendo uso de diferentes técnicas espectroscópicas tales como: espectroscopía de Fluorescencia, UV- visible y Dicroísmo Circular (CD).
En este trabajo presentamos los estudios realizados para caracterizar el proceso de asociación de los complejos [Cr(phen)2(dppz)]3+ y [Cr(phen)3]3+ frente a apo-Transferrina, haciendo uso de diferentes técnicas espectroscópicas tales como: espectroscopía de Fluorescencia, UV- visible y Dicroísmo Circular (CD).
2,3) en la membrana plasmática4, señalando a esta proteína como posible transportador de sensibilizadores catiónicos al interior de las células neoplásicas.En este trabajo presentamos los estudios realizados para caracterizar el proceso de asociación de los complejos [Cr(phen)2(dppz)]3+ y [Cr(phen)3]3+ frente a apo-Transferrina, haciendo uso de diferentes técnicas espectroscópicas tales como: espectroscopía de Fluorescencia, UV- visible y Dicroísmo Circular (CD).
2(dppz)]3+ y [Cr(phen)3]3+ frente a apo-Transferrina, haciendo uso de diferentes técnicas espectroscópicas tales como: espectroscopía de Fluorescencia, UV- visible y Dicroísmo Circular (CD).2. METODOLOGÍA.
2.1. Materiales.
2.1. Materiales.
Los complejos, Cr(phen)33+ y [Cr(phen)2(dppz)]3+ fue sintetizado por nuestro grupo, según procedimientos reportados en bibliografía1. La concentración de las soluciones de Cr(III) se determinaron por espectroscopía UV-visible.
La apo-Transferrina (Sigma) fue usada sin previa purificación. Todos los ensayos se realizaron en buffer 100mM Tris-HCl, 100mM NaCl, pH=7,4.
La apo-Transferrina (Sigma) fue usada sin previa purificación. Todos los ensayos se realizaron en buffer 100mM Tris-HCl, 100mM NaCl, pH=7,4.
33+ y [Cr(phen)2(dppz)]3+ fue sintetizado por nuestro grupo, según procedimientos reportados en bibliografía1. La concentración de las soluciones de Cr(III) se determinaron por espectroscopía UV-visible.La apo-Transferrina (Sigma) fue usada sin previa purificación. Todos los ensayos se realizaron en buffer 100mM Tris-HCl, 100mM NaCl, pH=7,4.
apo-Transferrina (Sigma) fue usada sin previa purificación. Todos los ensayos se realizaron en buffer 100mM Tris-HCl, 100mM NaCl, pH=7,4.2.2. Instrumental.
Los espectros de absorción fueron obtenidos con un Espectrofotómetro UV visible Agilent modelo 8453 con detector de arreglo de diodos, mientras que para las mediciones de fluorescencia en estado estacionario se empleo un espectrofluorómetro PTI Modelo QM2 (Quanta Master 2) de Photon Technology Internacional. Las medidas de CD se realizaron en un Espectropolarímetro JASCO J-810 a temperatura controlada usando una celda de 1 cm de paso óptico.
2.3. Estudios de Asociación
La espectroscopía de fluorescencia es un método ampliamente usado para el estudio de la interacción entre pequeñas moléculas y bio-macromoléculas. La fluorescencia en la apo-Transferrina se origina a partir de dos tipos de fluoróforos: el Triptófano (Trp) y la Tirosina (Tyr). Con el propósito de determinar si ambos fluoróforos
apo-Transferrina se origina a partir de dos tipos de fluoróforos: el Triptófano (Trp) y la Tirosina (Tyr). Con el propósito de determinar si ambos fluoróforos1 J. Toneatto, R. Boero, G. Lorenzatti, A.M. Cabanillas y G.A. Argüello, J. of Inorg. Biochem. 104 (2010) 697.
J. Toneatto, R. Boero, G. Lorenzatti, A.M. Cabanillas y G.A. Argüello, J. of Inorg. Biochem. 104 (2010) 697.2 L. Messori, F.G. Vilchez, R. Vilaplana, F. Piccioli, E. Alessio, B. Keppler, Met. Based Drugs 7 (2000) 335.
L. Messori, F.G. Vilchez, R. Vilaplana, F. Piccioli, E. Alessio, B. Keppler, Met. Based Drugs 7 (2000) 335.3 L. Messori, P. Orioli, D. Vullo, E. Alessio, E. Iengo, Eur. J. Biochem. 267 (2000) 1206.
L. Messori, P. Orioli, D. Vullo, E. Alessio, E. Iengo, Eur. J. Biochem. 267 (2000) 1206.4 W.P. Faulk, H. Harats, A. Berczi, (1990) in Oxidoreduction at the Plasma Membrane ( F.L. Crane, J.D. Morre, H. Low, eds) vol.1, pp. 205-224, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL.
W.P. Faulk, H. Harats, A. Berczi, (1990) in Oxidoreduction at the Plasma Membrane ( F.L. Crane, J.D. Morre, H. Low, eds) vol.1, pp. 205-224, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL.5 J. Bhattacharya, M. Bhattacharya,A. Chakraborty, U. Chowdhury. R. K. Podder, Biochem. Farmacol. 47 (1994) 2049.
J. Bhattacharya, M. Bhattacharya,A. Chakraborty, U. Chowdhury. R. K. Podder, Biochem. Farmacol. 47 (1994) 2049.están involucrados en el proceso de asociación, se comparó la fluorescencia de la proteína excitada a 280nm y 295nm (donde no absorbe el Trp). Las constantes de asociación se determinaron a partir del análisis de los cambios del espectro de emisión de la proteína a 320nm con el incremento de la concentración de complejo de Cr(III), usando la ecuación desarrollada por Bhattacharya5.
Se evaluaron, mediante ecuación de Van´t Hoff los parámetros termodinámicos ΔH, ΔS y ΔG, a fin de caracterizar las interacciones involucradas en el proceso de asociación de los complejos de Cr(III) a la apo-Transferrina.
H, ΔS y ΔG, a fin de caracterizar las interacciones involucradas en el proceso de asociación de los complejos de Cr(III) a la apo-Transferrina.3 RESULTADOS.
A partir del análisis de los datos experimentales se puede observar que la presencia de [Cr(phen)2(dppz)]3+ y [Cr(phen)3]3+ producen una importante inhibición (quenching) de la fluorescencia de la apo-Transferrina. De los datos de la variación de la intensidad de fluorescencia mediante el uso de la ecuación de Bhattacharya se determinaron las constantes de asociación (Kb) a diferentes temperaturas (294,5K, 299,0K, 302,5K y 308,5K), obteniéndose valores de constantes comprendidos entre 1,9x105 M-1 ? 2,5x105 M-1 para la asociación [Cr(phen)2(dppz)]3+-apo-Transferrina y entre 0,86x105 M-1 ? 1,5x105 M-1 para la asociación [Cr(phen)3]3+-apo-Transferrina. A partir de las Kb, se calcularon los parámetros termodinámicos, obteniéndose valores de ΔH y ΔS positivos y ΔG negativos en ambos casos.
2(dppz)]3+ y [Cr(phen)3]3+ producen una importante inhibición (quenching) de la fluorescencia de la apo-Transferrina. De los datos de la variación de la intensidad de fluorescencia mediante el uso de la ecuación de Bhattacharya se determinaron las constantes de asociación (Kb) a diferentes temperaturas (294,5K, 299,0K, 302,5K y 308,5K), obteniéndose valores de constantes comprendidos entre 1,9x105 M-1 ? 2,5x105 M-1 para la asociación [Cr(phen)2(dppz)]3+-apo-Transferrina y entre 0,86x105 M-1 ? 1,5x105 M-1 para la asociación [Cr(phen)3]3+-apo-Transferrina. A partir de las Kb, se calcularon los parámetros termodinámicos, obteniéndose valores de ΔH y ΔS positivos y ΔG negativos en ambos casos.4. CONCLUSIONES.
Los complejos [Cr(phen)2(dppz)]3+ y [Cr(phen)3]3+ se asocian a la Apotransferrina. En el proceso de asociación están involucrados ambos residuos Trp y Tyr, que de acuerdo a los valores de los parámetros termodinámicos obtenidos, el proceso entrópico sería espontáneo y entrópico en donde las interacciones hidrofóbicas juegan un rol muy importante en dicho proceso. No obstante, no podemos descartar que, procesos de naturaleza electrostática estén presentes, dada la carga de las especies involucradas. Los estudios de CD sugieren que la presencia de ambos complejos de Cr(III) generarían cambios estructurales de la proteína, siendo estos cambios mucho más marcados en presencia de [Cr(phen)2(dppz)]3+. Esto se correlaciona con que el complejo Cr(phen)2(dppz)]3+ presenta mayor constante de asociación.
Podemos concluir que la apo-Transferrina podría actuar como un posible transportador de los complejos Cr(III) al interior de las células. Más aún, y debido a la mayor expresión de los receptores de esta proteína en células tumorales, se favorecería la acumulación selectiva de los complejos Cr(III) en los tejidos neoplásicos .
Podemos concluir que la apo-Transferrina podría actuar como un posible transportador de los complejos Cr(III) al interior de las células. Más aún, y debido a la mayor expresión de los receptores de esta proteína en células tumorales, se favorecería la acumulación selectiva de los complejos Cr(III) en los tejidos neoplásicos .
2(dppz)]3+ y [Cr(phen)3]3+ se asocian a la Apotransferrina. En el proceso de asociación están involucrados ambos residuos Trp y Tyr, que de acuerdo a los valores de los parámetros termodinámicos obtenidos, el proceso entrópico sería espontáneo y entrópico en donde las interacciones hidrofóbicas juegan un rol muy importante en dicho proceso. No obstante, no podemos descartar que, procesos de naturaleza electrostática estén presentes, dada la carga de las especies involucradas. Los estudios de CD sugieren que la presencia de ambos complejos de Cr(III) generarían cambios estructurales de la proteína, siendo estos cambios mucho más marcados en presencia de [Cr(phen)2(dppz)]3+. Esto se correlaciona con que el complejo Cr(phen)2(dppz)]3+ presenta mayor constante de asociación.Podemos concluir que la apo-Transferrina podría actuar como un posible transportador de los complejos Cr(III) al interior de las células. Más aún, y debido a la mayor expresión de los receptores de esta proteína en células tumorales, se favorecería la acumulación selectiva de los complejos Cr(III) en los tejidos neoplásicos .
apo-Transferrina podría actuar como un posible transportador de los complejos Cr(III) al interior de las células. Más aún, y debido a la mayor expresión de los receptores de esta proteína en células tumorales, se favorecería la acumulación selectiva de los complejos Cr(III) en los tejidos neoplásicos .