El oxalato es un producto del metabolismo proteico el cual es eliminado por el riñón; es
tóxico a altas concentraciones debido a que forma complejos insolubles con cationes divalentes principalmente con calcio. Es el principal componente de la mayoría de los cálculos renales, por ello la determinación del nivel de oxalato en orina es de gran utilidad para el manejo de la urolitiasis.
El objetivo de este trabajo fue el desarrollo de un biosensor enzimático amperométrico para medición de oxalato, con rango analítico amplio y estabilidad mejorada comparado con sensores que utilizan albúmina en la matriz que contiene la enzima.
La medición de oxalato se basa en descomposición de éste por parte de la oxalato oxidasa, para dar CO2 y H2O2 de acuerdo con la siguiente reacción:
O2 + (COOH)2 ----- 2CO2 + H2O2
La cantidad de oxalato se determina indirectamente a través de la medición amperométrica de H2O2. La oxalato oxidasa fue inmobilizada en una matriz mucina/carbopol entrecruzada con glutaraldehido, contenida entre dos membranas poliméricas.
Mucina y oxalato oxidasa fueron obtenidas de Sigma Ltd, Carbopol 940 de Noveon, glutaraldehido de Mallinckrodt Baker , USA. Las membranas poliméricas utilizadas para contener la matriz fueron policarbonato de 0,05 mm de diámetro de poro y sulfonato polyeter sulfona- polyeter sulfota (SPEES-PES).
Las muestras de orina fueron provistas por el Hospital Privado de Córdoba.
Para la medición electroquímica del H2O2 se adaptó una celda para detección de oxígeno (Rank Brothers, Botisham, Cambridgeshire, UK), polarizando el electrodo de trabajo a +0.65 V (versus Ag/AgCl). Como fuente polarizante se utilizó un analizador electroquímico Autolabb (Ecochemie).
Para la preparación de los electrodos se mezclaron 6 ml de solución conteniendo la enzima (2.69 U /ml) en albúmina or mucina y carbopol (70:30 relación en peso) con 3 ml de glutaraldehido (5% v/v), se aplicó inmediatamente esta mezcla sobre una membrana de SPEES-PES y sobre esta se colocó una membrana de policarbonato. El sándwich resultante se colocó sobre el electrodo de trabajo de Pt.
Las curvas de calibración del electrodo se obtuvieron por adición de 40ml de solución de oxalato de sodio a 4 ml de buffer sucesivamente. Para análisis de selectividad se agregaron interferentes junto con las soluciones estándar y se registraron los cambios en la respuesta electroquímica. La estabilidad fue evaluada realizando curvas de calibración en días sucesivos.
Se observó un intervalo lineal de 2-400 mM después de una dilución 1/10 de las muestras de orina (correspondiente a 20-4000 mM) lo cual lo hace apropiado para uso clínico. Se encontró una alta correlación con el método espectrofótométrico de uso más frecuente (r2= 0.98 y= 0.89x, n=25) .
Los resultados demostraron que el carbopol estabiliza la matriz enzimática y que la mucina es la responsable del control difusional, lo cual significó una mejora en el intervalo lineal con respecto al sensor que utiliza albúmina como agente inmovilizante en la matriz