Previamente mostramos que DCs de bazo de ratones C57BL/6 incubadas con ovalbumina (OVA) en presencia de PolyU (ligando de TLR7) inducen una fuerte respuesta CTL anti-OVA, por un aumento de la presentacion cruzada de OVA. Esta presentación requiere la participación del canal Sec61 para la salida de OVA al citoplasma y su degradación por el proteosoma.
Para develar los mecanismos involucrados, evaluamos si la captura de OVA por DCs es afectada por PolyU. Se incubaron DCs con OVA-FITC m¨¢s PolyU estabilizado con DOTAP (PolyU/DO) o solo DOTAP. Por citometría de flujo observamos que DCs estimuladas con PolyU/DO capturan mas OVA que DCs incubadas solo con DOTAP (p<0,05).
A continuación medimos el valor de pH en fagosomas de DCs por citometría de flujo. El pH fagosomal es menos ¨¢cido en DCs que en otros fagocitos y esto se ha relacionado con su capacidad de realizar presentación cruzada de Ags. Encontramos que DCs estimuladas con PolyU/DO presentan fagosomas con un pH mas alcalino que las DCs no estimuladas (p<0,05) hasta 30 min post-estimulo. Luego evaluamos las consecuencias funcionales de dicho pH mas alcalino, en términos del procesamiento de OVA. Se determinó por citometría de flujo la cantidad de OVA remanente en DCs incubadas con perlas de latex conjugadas a OVA. Observamos una marcada degradación de OVA en DCs no estimuladas a diferencia de las DCs estimuladas con PolyU/DO (p<0,01).
Finalmente evaluamos la permanencia del complejo H-2Kb/OVA257-264 (MHC I/Ag) en la superficie de DCs incubadas con el p¨¦ptido OVA257-264 en presencia de PolyU/DO o DOTAP por 90 min. Luego, fueron marcadas con una IgG1 que reconoce el complejo H-2Kb/OVA257-264 e incubadas por distintos tiempos. Finalmente, se utiliz¨® un anticuerpo anti-IgG1 para detectar los complejos en la superficie celular. DCs tratadas con PolyU/DO mostraron una mayor permanencia del complejo H-2Kb/OVA257-264 sobre su superficie que DCs en condiciones basales (p<0,05), en particular en DCs convencionales CD8¦Á+ y en DCs plasmacitoideas.
En conclusión, PolyU estimula la presentación cruzada en DCs aumentando la captura de Ags y su preservación, probablemente impidiendo la acidificación fagosomal temprana y así evitando una excesiva degradación de Ags. Además, PolyU aumenta la estabilidad de los complejos H-2Kb/OVA257-264 sobre la superficie de la DC, incrementando las posibilidades de interactuar con los TCR de los linfocitos T CD8.
