EXPRESIÓN ALTERNATIVA Y CARACTERIZACIÓN DEL PROMOTOR DE ZFHEP, UN FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN ACTIVADOR DEL RECEPTOR DE VITAMINA D3.
M.S. Torgnelli, M.M Remedi, D.S. Darling y A.M. Cabanillas. Dpto. De Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Cördoba
La vitamina D3 (vit D3) tradicionalmente ejerce su efecto biológico sobre hueso e intestino. Además, se han identificado al tejido miocárdico como sitio de acción ?no tradicional? para el efecto transcripcional de su receptor (VDR) en respuesta a vit D3. Se han identificado VDR en miocitos cardíacos, y se ha involucrado a la vit D3 en la maduración de este tipo celular. Zfhep (Zinc Finger Homeodomain Enhancer Protein) es un nuevo factor de transcripción de la familia de las proteínas zinc finger/homeodominio (ZF/H). Zfhep está involucrada en la diferenciación muscular y hematopoyesis. Zfhep se expresa en hipófisis, SNC y corazón como dos isoformas del mRNA, Zfhep-1 y Zfhep-2. Se ha reportado recientemente que Zfhep activa la transcripción del VDR por lo que se la ha involucrado en los efectos diferenciadores de vit D3 durante el desarrollo embrional. Ya que los ratones knock-out para Zfhep y para VDR exhibieron rasgos fenotípicos semejantes es posible pensar que podría haber un control mutuo entre la expresión de Zfhep y VDR con el objeto de promover la diferenciación celular y el desarrollo. No se ha investigado, aún, acerca de la regulación del gen de Zfhep. Nuestro objetivo general, es la caracterización del promotor de Zfhep en distintas líneas celulares y a más largo plazo, el efecto de vit D3 sobre su expresión. Recientemente se ha demostrado que otro miembro de la familia ZF/H, ATBF-1, expresa sus isoformas mediante la activación de dos promotores alternativos. Por lo tanto, los primeros estudios se dirigieron a investigar si la expresión de las isoformas de Zfhep responde a dos promotores alternativos. A tal fin se realizaron estudios de RT-PCR a partir de RNA total humano que permitieron demostrar que la secuencia 5' flanqueante de Zfhep-2 se encuentra corriente abajo de la secuencia del primer exon de Zfhep-1, indicando que ambas isoformas serían transcriptas a partir de dos promotores diferentes. Posteriormente, se procedió al aislamiento de los promotores de las isoformas Zfhep-1 (Z-1) y Zfhep-2 (Z-2) humano por PCR a partir de DNA genómico humano. Los fragmentos obtenidos (1000 pb para Z-1 y 1606 para Z-2) fueron subclonados en pGL3-basic que expresa luciferasa como gen reportador. Estos constructos fueron transfectados por precipitación con fosfato de calcio junto al vector de b-galactosidasa (control interno de transfección) a las líneas celulares P19 (teratocarcinoma embrionario indiferenciado), C2C12 (mioblasto de ratón), COS-7 (riñón de mono), y JEG-3 (coriocarcinoma humano). La actividad de luciferasa fue calculada como Unidades Relativas de Luz normalizada con la actividad de b-galactosidasa de la misma muestra. Las diferencias entre medias fue evaluada por ANOVA y como test a posteriori se usó Student-Neuman-Keuls. La actividad de Z-1p1000Luc fue entre 10-20 (COS-7), 12 (JEG-3), 10 (C2C12) y 10-20 (P19), veces mayor que la del control pGL3-basic (P< 0.01) en las líneas celulares indicadas. La actividad de Z2p1606Luc fue 4 veces superior (P< 0,05) al control en C2C12 y nula en COS-7 y JEG-3 demostrando que hay una actividad específica de tipo celular de este promotor alternativo. Conclusión: Estos resultados permitieron identificar al promotor de Zfhep humano y muestran que 1) las dos isoformas del gen son reguladas por dos promotores diferentes a pesar de pertenecer al mismo gen, 2) estos promotores son activos en distintos tipos celulares y 3) de los tipos celulares estudiados, sólo las células precursoras de célula muscular expresan el promotor de Zfhep-2. Esto deja abierta la posibilidad que tengan lugar mecanismos de acción diferenciados para la acción biológica de Zfhep.
