DISEÑO Y DESARROLLO DE SISTEMAS MICRO/NANOPARTICULADOS DE SUSTANCIAS BIOACTIVAS PARA USO EN MEDICINA VETERINARIA Y HUMANA.

SOLEDAD RAVETTI, SANTIAGO DANIEL PALMA, JAQUELINA CONCEPCIÓN RUBIOLO, SOFÍA GISELLA BRIGNONE, RAÚL JOSÉ MARCHEGGIANI, GUILLERMINA BUDANO, FRANCO ANTONIO MANZANELLI, GONZALO JESÚS BECCHERO, MARIANA GUADALUPE VALLEJO, MARÍA JULIANA FAVA,; BELKYS A. MALETTO

Jornada; XIII Jornadas de Investigación. "Producción de conocimiento en contexto de Pandemia" - Universidad Nacional de Villa María.; 2021

Frente a los fracasos terapéuticos en el tratamiento de infecciones bacterianas locales o sistémicas, surge la necesidad de optimizar la terapia utilizando la potenciación en tratamientos combinados, entre antimicrobianos (ATM) e inmunomoduladores con propiedades farmacológicas adecuadas. Algunos antimicrobianos, tienen la particularidad de alcanzar altas concentraciones intracelulares, en las células tisulares y células del sistema inmune como polimorfonucleares (PMN) y monocitos. Esto es de extrema relevancia ya que la droga incorporada dentro de la célula fagocítica puede actuar como complemento en la destrucción de las bacterias susceptibles que se encuentran colonizando el tejido blanco infectado. Las sustancias inmunoestimulantes se han definido como sustancias que activan el sistema inmune de individuos eucariotas aumentando la resistencia frente a las enfermedades infecciosas. De esta manera, se logra la activación y potenciación del sistema inmune, lo que genera un aumento de la resistencia frente a diferentes enfermedades mediante un incremento en los mecanismos de defensa específicos e inespecíficos. A las sustancias inmunoestimulantes se las enmarca como agentes profilácticos primarios. Asimismo, en el área de la inmunología, se los conoce como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs en inglés pathogen associated molecular patterns) que son los ligandos de los PRRs (Receptor de Reconocimiento de Patrones). Las sustancias inmunomoduladoras pueden ser obtenidas a partir de diferentes tipos de microorganismos (levaduras y/o bacterias) o a partir de células eucariotas como es el caso del ADN aislado de espermatozoides del toro. Estos productos presentan una gran demanda en medicina veterinaria y humana, lo que ha generado la búsqueda y desarrollo de nuevos compuestos que presenten alta efectividad asociada a baja toxicidad. La pared celular de Saccharomyces cerevisiae (levadura-hongo unicelular (EPL)) presenta un efecto inmunomodulador debido a la presencia de β-glucanos. Los β-(1-3) glucanos lineales son homopolisacáridos en los que las moléculas de glucosa están unidas entre sí por un enlace β-glucosídico conformando cadenas lineales insolubles en agua. Los β-glucanos son reconocidos por las células del sistema inmune innato a través de receptores de reconocimiento de patrones (PRRs), tales como los receptores tipo Toll (TLR) y los receptores de lectina de tipo C (CLR). La cooperación de dos PRRs (TLR-2 y Dectina 1) desencadena la activación de cascadas de señales intracelulares por medio de moléculas adaptadoras y cinasas que conducen a la activación de factores de transcripción de diferentes familias (cinasas de la familia MAP, NF-kB y los IRF). Estos factores se traslocan al núcleo con el objetivo de estimular la expresión de diferentes genes que codifican la producción de variadas sustancias como: especies reactivas del oxígeno, TNF-α, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-10 y IL-12p40, las cuales desencadenan una respuesta inmune sesgada mediada por células Th1 y Th17. El consumo de β-glucanos se ha relacionado con efectos beneficiosos para la salud en los seres humanos. Se han descrito propiedades como antitumorales, prevención del síndrome metabólico, reductor del colesterol, antiaterogénico y promotor de la salud de la piel. Por otro lado, el semen de toro es un fluido corporal segregado por las gónadas de los animales machos. El ADN de las células de este líquido seminal contiene, a diferencia de las células somáticas, motivos CpG (citosina-fosfato-guanina) submetilados capaces de actuar como secuencias inmunoestimuladoras. Esto se debe a sus formidables propiedades inmunoactivadoras, actuando como agonistas de receptores Toll Like 9 (TLR-9), lo que permite una amplia gama de aplicaciones terapéuticas (protección del huésped contra patógenos infecciosos, reducción de respuestas alérgicas, adyuvantes en el desarrollo de vacunas y facilitadores en el tratamiento de neoplasias solo o en combinación con otras terapias). La eficacia de ambos inmunomoduladores puede verse comprometida cuando se administran por la vía oral debido a las características del tracto gastrointestinal, por lo cual las estrategias de formulación adquieren una importancia fundamental. Por otro lado, cuando una molécula biológicamente activa, se administra en una forma farmacéutica convencional (comprimido, inyectable, etc.), el fármaco es liberado rápidamente y sin restricciones en el organismo. Las propiedades fisicoquímicas de la molécula (solubilidad, ionización, lipofilicidad, etc.) condicionan su eventual absorción a través de las membranas biológicas y por lo tanto su biodisponibilidad. Esto se ve agravado cuando su administración es vía oral. Esto puede traer aparejado una disminución de la efectividad de la farmacoterapia y en numerosas ocasiones la aparición de efectos adversos. En los últimos años se ha incrementado el desarrollo de sistemas o dispositivos que permiten que un fármaco pueda liberarse de manera controlada o bien orientarse a una región determinada del organismo. Es así como la investigación en sistemas de liberación modificada ha experimentado un desarrollo importante, avalada tanto por el conocimiento farmacocinético de los medicamentos como por los grandes avances en la obtención de nuevos materiales que pueden utilizarse. Por todo esto, el diseño de sistemas multiparticulados, diseñados para mantener inalteradas la/s molécula/as activas es una estrategia tecnológica de alto impacto. Las multipartículas minimizan el riesgo de irritación local y la posible retención de los excipientes no digeribles en caso de administración crónica. Los multiparticulados son sistemas versátiles debido a que se pueden obtener productos orales de liberación modificada con distintos perfiles combinando en una misma unidad de dosis simple (comprimido o cápsula), micropartículas, nanopartículas o gránulos con diferentes composiciones y/o diferentes velocidades de liberación, para de este modo lograr el perfil de liberación deseado. A partir de lo descripto anteriormente es que objetivo general del proyecto será el desarrollo de esquemas generales de prevención que incluyen la obtención, caracterización, evaluación y aplicación de inmunomoduladores a través de sistemas multiparticulados (micro y nanopartículas) con el propósito de incrementar la eficacia de los antimicrobianos (ATM) utilizados, disminuyendo en tiempo los regímenes terapéuticos convencionales, aumentar los intervalos entre dosis y disminuir la cantidad del ATM utilizado; sin comprometer el desarrollo de resistencia bacteriana y generándose de esta manera un nuevo aspecto fármaco-terapéutico que pueda tener alto impacto en la clínica médica ordinaria para el control de infecciones agudas y crónicas en medicina veterinaria. El grado de avance del proyecto se puede resumir en dos secciones principales: 1- ((1-3),(1-6)-β-d-glucano a partir de extracto de pared de levadura de Saccharomyces cerevisiae (EPL) 1.1- La vehiculización de EPL a través del diseño y desarrollo de micropartículas obtenidas a partir de esferas de azúcar (MEA), haciendo uso de un equipo de lecho fluidizado. Con el objetivo de conocer la influencia de la formulación y de las condiciones operativas sobre la calidad y rendimiento del producto final se emplearon facultades estadísticas (diseño estadístico factorial fraccionado), estudiando el recubrimiento de las micropartículas con polímeros sintéticos, otorgando una cubierta gastrorresistente a las mismas y evaluando las características físicoquímicas de las micropartículas, principalmente utilizando la técnica de microscopía electrónica de barrido con detector EDS (SEM-EDS). 1.2- La cuantificación de (1-3),(1-6)-B-d-glucano a partir de EPL. EPL muestra una baja solubilidad en agua, Tween 80 y etanol. En una primera etapa se cuantificó por espectrofotometría ultravioleta (UV) pero nos resultó difícil de extrapolar en la liberación. Luego de la búsqueda de diferentes técnicas decidimos realizar la cuantificación utilizando un método enzimático. El kit comercializado por Megazyme ofrece un procedimiento de hidrólisis ácida/enzimática (K-YBGL) para la determinación de β-glucano en levaduras y hongos, que se basa en el método de extracción del método de McCleary. A partir de la metodología desarrollada se logró determinar el contenido de interés en el EPL a partir de un método de cuantificación rápido y preciso y se pudo adaptar el procedimiento enzimático estándar a muestras de diferentes pesos con adecuada reproducibilidad analítica. 1.3- La vehiculización de EPL a través del diseño y desarrollo de nanopartículas. En proceso de patentado. 2- ADN con motivos citosina-fosfato-guanina (CpG-ADN) submetilados La extracción del CpG-ADN se obtuvo a partir de esperma de toro. La novedosa metodología que propusimos para alcanzar este propósito se estableció a partir de modificaciones del método planteado por Weyrich A (2012) con la combinación de la técnica de extracción de un kit comercial. Las diferencias sustanciales con Weyrich A (2012) se basaron en el prelavado del esperma con PBS (estéril), aumento en la concentración de Triton-X100, DTT y proteinasa K para la lisis de las células y digestión de proteína, y el uso de Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit para la extracción final de ADN y posterior elución. En base al análisis de los resultados obtenidos podemos inferir que se obtuvo ADN de una pureza aceptable debido a que presenta una relación de absorbancias de 260/280>1,6. Dada la necesidad de un protocolo simple y rápido para el aislamiento del ADN espermático de semen bovino, los resultados de estos estudios brindan un enfoque novedoso donde se combinan técnicas que permitieron aislar material genético de alta pureza. Con el objetivo de optimizar aún más la metodología de trabajo y el tiempo de procesamiento, se examinaron detalladamente los protocolos actuales donde se pudo lograr mejoras considerables utilizando reactivos disponibles comercialmente. Mediante los diferentes métodos de análisis se pudieron obtener resultados prometedores con respecto a la pureza e integridad del ADN extraído. Además, esta metodología combinada podría ser usada en la extracción de ADN a partir del semen de otras especies de mamíferos.