ANTECEDENTES
El aminoácido glutamato es el principal neurotransmisor excitador en el sistema nervioso central. La glutaminasa juega un importante papel en cerebro, ya que es la principal enzima implicada en la producción de glutamato a partir de glutamina. Sin embargo el papel de la glutaminasa en la regulación de los niveles de glutamato en cerebro no está bien comprendido. La propuesta de una lanzadera de glutamina-glutamato entre la neurona y la célula glial que recircula el glutamato (1) está en entredicho, entre otras razones por la suposición de la presencia en cerebro de una sola de las isoenzimas de glutaminasa, la isoenzima K. La reciente descripción en cerebro de la isoenzima L (2) por nuestro grupo de investigación, aporta nuevas evidencias de una papel más activo de la glutaminasa en el aporte de glutamato para la neurotransmisión sináptica. La glutaminasa L en cerebro tiene, además, una localización diferente de la usual, que es mitocondrial, ya que se ha encontrado localizada en núcleo de neuronas.
La coexpresión de dos isoenzimas de glutaminasa en cerebro, al igual que ocurre con la existencia de dos isoenzimas para la síntesis de GABA, abre nuevas e importantes interrogaciones relacionadas con la regulación de los niveles de glutamato en neuronas, así como el por qué de la presencia de la isoenzima L en núcleo y de cómo es transportada hasta allí.
Además de su función como enzima, la glutaminasa L contiene numerosos motivos consenso y dominios estructurales que la hacen candidata a ser una proteína multifuncional (3). Mediante un rastreo de doble híbrido se han encontados numerosas proteínas interactoras, confirmándose hasta la fecha la proteína glutaminase interacting protein (GIP) como interactor fisiológico mediante un motivo de unión a proteínas PDZ (4). Nuestro grupo de investigación ha caracterizado la existencia de una modificación postraduccional consistente en la modificación por O-glicosilación (resultado no publicado). La O-glicosilación de proteínas es una modificación dinámica que modifica la función de proteínas, entre las que se encuentran numerosos factores de transcripción, y que funciona de una forma similar a la modificación por fosforilación. Esta modificación está también implicada en el transporte de proteínas al núcleo (4).
La estancia de la Doctora Ana Carolina Donadio estará enmarcada en la caracterización funcional de la modificación por O-GlcNAc de la isoenzima L de la glutaminasa en neuronas, y en una colaboración que dio sus frutos en una previa estancia suya en nuestro laboratorio y que permitió dilucidar diversos aspectos que imbrican a la glutaminasa y la ruta de las hexosaminas, la cual provee el sustrato para la O-glicosilación de proteínas (5).
Los OBJETIVOS del presente proyecto conllevan la caracterización funcional de la modificación por O-GlcNAc de la isoenzima L de la glutaminasa en neuronas, campo de estudio que actualmente desarrolla nuestro grupo de investigación de una forma activa. Concretamente esta propuesta se plasma en dos objetivos claros:
- Mapeo del sitio de O-Glicosilación de la glutaminasa L humana.
- Efecto de la O-glicosilación de la glutaminasa L en el importe al núcleo.
METODOLOGÍA
Los dos objetivos planteados se cubrirán con la siguiente metodología:
1. Mapeo del sitio de O-Glicosilación de la glutaminasa L humana
Se llevará a cabo mediante el método BEMAD (6), usando espectrometría de masas MALDI-TOF con péptidos de glutaminasa L obtenidos mediante digestión con tripsina. Células del neuroblastoma humano SH-SY5Y serán cultivadas in vitro con streptozocin (ATZ), una análogo de la N-acetilglucosamina. STZ inhibe selectivamente la actividad de la N-acetyl-beta-D-glucosaminidase, enzima que elimina los residuos de O-GlcNAc de las proteínas, resultando en la O-hiperglicosilación de proteínas. La glutaminasa L endógena será inmunoprecipitada usando un anticuerpo específico y separada mediante electroforesis 2D.
2. Efecto de la O-glicosilación de la glutaminasa L en el importe al núcleo.
Estudios preliminares de nuestro grupo de investigación han revelado que el tratamiento con el éster de forbol PMA incrementa la acumulación nuclear de la glutaminasa L. Se llevarán a cabo experimentos en los que se incubarán células SH-SY5Y con alloxan, un inhibidor específico de la O-GlcNAc transferasa, o con STZ junto con PMA. La acumulación de glutaminasa L en el núcleo se estudiará mediante el aislamiento de proteínas nucleares y Western blot con anticuerpos anti glutaminasa L. Para determinar la fracción de glutaminasa L O-glicosilada se usará el anticuerpo RL2, que reconoce específicamente residuos de O-GlcNAc en proteínas, en Western blot de proteína glutaminasa inmunoprecipitada con anticuerpos anti glutaminasa L. También se estudiará el efecto del PMA mediante el uso de inhibidores específicos de su cascada de señalización, como el bisindolil maleimida, un inhibidor de la PKC alfa. Esto nos permitirá detectar señales específicas que induzcan la traslocación de la glutaminasa L al núcleo.
CRONOGRAMA
Durante la estancia de 4 meses de la Doctora Ana Carolina Donadio se establecerán contactos e intercambio de experiencias que permitirán desarrollar la metodología anterior en dicho tiempo. Se iniciarán en primer lugar los estudios de mapeo, ya que una vez obtenidos los inmunoprecipitados, los análisis de espectrometría de masas serán realizados por personal externo especializado. Está previsto que esta primera fase se realice en dos meses. A partir de entonces se iniciarán los estudios de importe al núcleo los que se estima lleven 2 meses mas.
Referencias
1. Laake, JH, Slyngstad TA, Haug FM, Ottersen OP, 1995. Glutamine from glial cells is essential for the maintenance of the nerve terminal pool of glutamate: immunogold evidence from hippocampal slice cultures. J. Neurochem J. Neurochem. 65, 871-881.
2. Olalla L, Gutiérrez A, Campos JA, Khan ZU, Alonso FJ, Segura JA, Márquez J, Aledo JC, 2002. Nuclear localization of L-glutaminase in mammalian brain. J. Biol. Chem. 277, 38939-38944
3. Márquez J, López de la Oliva AR, Matés JM, Segura JA, Alonso FJ, 2006. Glutaminase: a multifaceted protein not only involved in generating glutamate. Neurochem. Int. 48, 465-471
4. Hart GW, Housley MP, Slawson C, 2007. Cycling of O-linked β-N-acetylglucosamine on nucleocytoplasmic proteins. Nature 446, 1017-1022.
5. Donadio AC, Lobo C, Tosina M, de la Rosa V, Martin-Rufian M, Campos-Sandoval JA, Mates JM, Marquez J, Alonso FJ, Segura JA, 2008. Antisense glutaminase inhibition modifies the O-GlcNAc pattern and flux through the hexosamine pathway in breast cancer cells. J Cell Biochem. 103, 800-811.
6. Vocadlo DJ, Hang HC, Kim EJ, Hanover JA, Bertozzi CR., 2003. A chemical approach for identifying O-GlcNAc-modified proteins in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9116-9121
