INMUNOPURIFICACIÓN DE FOSFOLIPASA A2 SECRETORIA DE SEMILLA DE SOJA (Glycine max)

SAN JUAN

Jornada; XIII JORNADAS SOC ARG BIOLOGIA Y 2DA. REUNION CONJUNTA DE SOC. DE BIOLOGIA DE LA RA; 2011

SOCIEDAD ARGENTINA DE BIOLOGIA

Objetivos. Fosfolipasa A2 (PLA2, EC 3.1.1.4) de semilla de soja (Glycine max) (GmPLA2) fue parcialmente purificada y caracterizada bioquímicamente por nuestro equipo en un trabajo anterior. Esta nueva enzima lipolítica presenta propiedades similares a PLA2s secretorias (sPLA2s) de animales y venenos, y de acuerdo con estudios de biología molecular puede incluirse en el grupo XI (plantas) de la superfamilia PLA2. Tiene importancia biotecnológica porque cataliza la hidrólisis de fosfolípidos, formando lisofosfolípidos, poderosos bioemulsificantes. El objetivo del presente trabajo fue: obtener GmsPLA2 pura hasta homogeneidad, a los efectos de realizar estudios estructurales, cinética interfacial e investigar afinidad con ligandos. Métodos. Anticuerpo policlonal IgG anti sPLA2 Bothrops alternatus (yarará grande) fue inmovilizado covalentemente en polímeros acrílicos macroporosos Eupergit^® C y C250 (Degussa, Alemania) que presentan oxiranos (600 y 200 µmol/g) como grupos reactivos. 100 mg de soporte seco se incubaron 66 hs a 20^◦C con 0,5 y 0,6 mL de solución de anticuerpo (2 mg/mL) en buffer borato. Luego, se aplicó Tris 200 mM para bloquear oxiranos no reaccionados. La fracción con actividad PLA2 colectada de cromatografía en columna de afinidad utilizando Cibacron Blue como ligando inmovilizado, fue incubada con los sistemas anticuerpos inmovilizados (400 mg gel Ac-Eupergit C y 600 mg gel Ac-Eupergit C250) durante 16 hs a 20^◦C. Se eluyó en batch, con glicerol 30 % p/p en hidróxido de amonio 0,15 M. Se investigó actividad enzimática PLA2 eluída, contra liposomas de lecitina de soja,  mediante estudio cinético de la absorción aparente a 340 nm. Resultados. A partir de tres experimentos independientes de inmunopurificación, se obtuvo que los sistemas Ac-Eupergit C y C250 asociaron reversiblemente 29 ±2 unidades PLA2 (factor purificación= 6,1; rendimiento= 19,1 %) y 17 ±1 unidades PLA2 (factor purificación= 5,1; rendimiento= 11,2 %), respectivamente. Electroforesis SDS-PAGE de eluídos Ac-Eupergit?s reveló presencia de dos únicas bandas compatibles con proteínas de 11 y 13  kDa, correspondientes a dos isoespecies o dos grupos homólogos GmsPLA2 en coincidencia con estudios de biología molecular realizados por nuestro grupo. Conclusiones. Anticuerpo policlonal anti-BasPLA2 inmovilizado covalentemente en Eupergit, unió específica y reversiblemente la enzima GmsPLA2, siendo obtenida por primera vez, pura hasta homogeneidad. Tópico Temático. Bioquímica Vegetal (BV).