Desarrollo y validación de un procedimiento por HPLC para la cuantificación de diclofenac en estudios de absorción ocular en conejos

MAITRE MARCOS M., SILVA-JÚNIOR ARNOBIO A., OLIVEIRA ANSELMO G., LONGHI MARCELA R., GRANERO GLADYS E.

Buenos Aires

Congreso; XI Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2007

INTRODUCCIÓN: El diclofenac es un antiinflamatorio no esteroideo (AINE) con efecto analgésico, antiinflamatorio y antipirético. Una solución de diclofenac al 0,1% (p/v) se aplica en forma tópica durante la cirugía de cataratas para prevenir la miosis y luego de la misma, como tratamiento profiláctico, para prevenir el desarrollo de edema macular cístico. Algunos estudios de absorción ocular in vitro, utilizan cornea aislada proveniente de conejos y montadas en cámaras de difusión modificada. El procedimiento analítico para cuantificar el fármaco en estudio, es muy importante para asegurar la calidad de las determinaciones en este tipo de estudios de liberación a través de la córnea. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un procedimiento analítico por HPLC para cuantificar diclofenac en estudios de absorción ocular in vitro. La validación del mismo involucra la obtención de parámetros analíticos que garantizan los resultados.

MATERIALES Y MÉTODOS: Se utilizó un equipo de HPLC (Separation Module Waters 2695) con inyección automática y un detector de arreglo de diodo (Photodiode Array Detector Waters 2996) cuya longitud de onda se fijó a 278 nm. La separación se realizó con una columna de fase reversa (Symmetry®) C18  de 150 mm x 4,6 mm con un tamaño de partículas de 5 µm y una precolumna termostatizadas a 40 ± 2˚C con un horno. La fase móvil estuvo compuesta por metanol y una solución H₃PO₄ 50mM de pH 4,0 (70:30). El flujo de la fase móvil fue de 0,6ml/min. El modo de elusión fue isocrático. Se inyectaron 50µl de muestra. El diclofenac neutro se obtuvo a partir de la sal sódica por acidificación con HCl. El humor acuoso fue obtenido de conejos neozelandeses. El material biológico fue centrifugado a 25˚C durante 10 minutos a 18000G y posteriormente, el sobrenadante se filtró con membranas de PVDF HV de 0,45µm (DURAPORE São Paulo, SP, Brasil Millipore).

RESULTADOS: El pico cromatográfico del diclofenac (t_R = 6,25 min) no es interferido por los componentes de la matriz biológica ni por el PBS. La curva de calibrado fue lineal en el rango de concentraciones de 50-2500 ng/ml, dando origen a la siguiente ecuación y  = 188,4 x + 2743,9  r²=0,999. El límite de detección fue de 18 ng/ml, mientras que el límite de cuantificación fue de 61 ng/ml. La precisión intradiaria se determinó a 3 niveles de concentración (750, 1250 y 2000 ng/ml) obteniéndose los siguientes resultados de desviación estándar  relativa porcentual (RSD%): 0,97, 1,25 y 1,81 respectivamente. La precisión interdiaria se determinó a 3 niveles de concentraciones citados precedentemente, obteniéndose los siguientes resultados de desviación estándar  relativa porcentual (RSD%): 4,41, 5,45 y 7,01 respectivamente. El porcentajes recuperación estuvo comprendido entre 86-115 %.

CONCLUSIÓN: Esta metodología puede ser aplicada satisfactoriamente para determinar la concentración de diclofenac en estudios de absorción ocular in vitro.