IMPLEMENTACIÓN DE UN PROTOCOLO DE DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTES HUMANAS EN NEURONAS

REMEDI MM; GASTALDI L; MOYANO AL; CARDOZO-GIZZI A; WILSON C; CACERES A

Cordoba

Jornada; III Jornadas Avances en Medicina Traslacional; 2022

Instituto Universitario de Ciencias Biomedicas de Cordoba

Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs, human induced pluripotent stem cells) son generadas a partir de fibroblastos reprogramados, pudiendo diferenciarse, entre otros, en progenitores neurales y neuronas bajo condiciones apropiadas. Estas células están siendo utilizadas como modelo para explorar mecanismos celulares y moleculares de neuropatologías y testeo de drogas. En el LINCEMA implementamos un protocolo para generar neuronas funcionales de cerebro anterior. A partir de hiPSCs se indujo la generación de progenitores neurales y su posterior diferenciación final (DF) a neuronas corticales. Mediante técnicas de inmunocitoquímica y microscopía confocal el modelo fue caracterizado evaluando el enriquecimiento neuronal (% de neuronas vs otras células) y el largo neurítico en distintos tiempos de cultivo (días in vitro, DIV). Además, el fenotipo neuronal fue determinado mediante la detección de marcadores moleculares específicos (vGlut, GFAP y TH), mientras que la excitabilidad celular fue analizada dentro de los primeros 10 DIV mediante registros de la entrada de Ca2+ usando la sonda Fluo4-AM en neuronas estimuladas con 60-120 mM KCl.Se observó la presencia de progenitores (Rosetas Neurales) a los 15 días de iniciada la diferenciación, seguido por un periodo de expansión (Neuroesferas) hasta el día 28. En el día 1 de la DF (1 DIV) se observaron progenitores y un bajo porcentaje de neuronas, aumentando éstas con los días, alcanzando un 50% a los 7 DIV. La inmunomarcación indicó mayoritariamente la presencia de neuronas glutamatérgicas (vGlut+), y un bajo porcentaje de células gliales. Por último, mediante microscopía confocal se pudo determinar que las neuronas se vuelven progresivamente excitables dentro de los primeros 10 DIV, incrementando aproximadamente un 20% la entrada de Ca2+ extracelular luego de la estimulación con KCl.La implementación de este modelo constituye la base de diversos proyectos de investigación en curso en el CIMETSA, que incluyen entre otros Alzheimer familar, genética y epigenética del desarrollo neuronal, vesículas extracelulares, generación de organoides y neurotoxicidad.