Validation of laser-induced choroidal neovascularization (CNV) mouse model

BARCELONA PF; SUBIRADA CALDARONE PAULA; SAABI N; MARQUEZ MA; VAGLIENTI MV; RIDANO MAGALI E; MARQUEZ G; MARIA CONSTANZA PAZ;; LUNA JD; SANCHEZ MC,

Congreso; XII Congreso nacional de la Asociación de Investigación en Visión y Oftalmología (AIVO); 2018

Introducción. La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) en su forma neovascular es una de la principales causas de pérdida de la visión en adultos mayores de 55 años. En este estudio validamos un procedimiento establecido para la inducción de la neovascularización coroidea (CNV, por sus siglas en inglés) en ratones. Este procedimiento consiste en la perforación de la membrana de Bruch mediante fotocoagulación inducida por láser, reproduciendo la forma neovascular de DMAE.Objetivo. Caracterizar el proceso neovascular y su impacto en la funcionalidad retinal así como su perfil inflamatorio. Los trabajos previos realizados en nuestro laboratorio demostraron que tanto α2M y su receptor (LRP1) participan durante la neovascularización retinal, por lo que también nos centramos en la participación del sistema α2M/LRP1.Métodos. A ratones C57BL/6, 3-6 meses de edad, previamente anestesiados, se les practicaron cuatro lesiones de fotocoagulación por ojo con un láser de argón verde. Después de 7 días de realizadas las quemaduras por láser, analizamos las lesiones de neovascularización en flatmount de coroides-EPR mediante tinción con isolectina B4 utilizando microscopía confocal. Al mismo tiempo, mediante inmunotinción de marcadores específicos se caracterizaron las diferentes poblaciones celulares localizadas en el área de la lesión: CD105 (célula endotelial), NG2 (pericitos), F4/80 (microglía), así como la distribución del receptor LRP1 en estas células. Además, los niveles de proteína de α2M y LRP1 se analizaron por ensayos de WB y el perfil inflamatorio, evaluado por los niveles de IL1β, IL6 y TNFα mediante ensayo de qPCR. La funcionalidad de la retina se evaluó mediante ERG escotópico.Resultados. Pudimos estandarizar el tamaño de la lesión. Se observó una cantidad importante de célula endotelial y pericitos alrededor de la lesión. Las células de la microglía se localizaron en el área central y periférica de la lesión, mientras que α2M y LRP1 mostraron un aumento en el nivel de proteína acompañado de un gran patrón de expresión en células cercanas a la lesión; como así también se evidenciaron altos niveles de factores proinflamatorios y proangiogénicos. Las ondas a y b de ERG escotópico se redujeron (p <0,05) en los ojos de animal con la lesión CNV respecto de los que no recibieron el tratamiento con láser.Conclusiones. Pudimos reproducir y validar el modelo CNV en nuestro laboratorio, que nos brinda la posibilidad de evaluar la participación del sistema α2M/LRP1. Financiación. SeCyT-UNC 2017, FoNCyT 2015, FoNCyT 2016.Validation of a laser-induced choroidal neovascularization (CNV) mouse modelIntroduction. Age-related macular degeneration (AMD) in its neovascular form is one of the leading causes of visual loss in adults over 55 years of age. In this study we validate an established procedure for induction of choroidal neovascularization (CNV) in mice. This procedure involves perforation of Bruch?s membrane using laser-induced photocoagulation to reproduce neovascular AMD.Objective. Our goal was to characterize the neovascular process and its impact on retinal function, as well as its inflammatory profile. Previous investigations carried out in our laboratory demonstrated that both α2M and its receptor (LRP1) are involved in retinal neovascularization and, therefore, we also focused on the involvement of the α2M/LRP1 system.Methods. With the use of an argon green laser we induced four photocoagulation injuries in one eye of C57BL/6 previously anesthetized mice aged 3-6 months. After 7 days of laser-induced burns, we analyzed neovascularization injures in choroid/RPE flat-mounts using Isolectin B4 staining and confocal microscopy. In addition, immunostaining of specific markers was used to characterize the different cell populations located in the area of the injury: CD105 (endothelial cell), NG2 (pericytes), F4/80 (microglia), as well as distribution of the LRP1 receptor in these cells. Moreover, α2M and LRP1 protein levels were analyzed by WB assays, while the inflammatory profile was evaluated based on IL1β, IL6 and TNFα levels using qPCR assays. Retinal function was assessed by scotopic ERG.Results. We were able to standardize the injury?s size. A significant amount of endothelial cell and pericytes were observed around the injury. Microglial cells were located in the central and peripheral areas of the injury, while α2M and LRP1 showed a rise in protein levels associated with a great expression pattern in cells located close to the injury. High levels of proinflammatory and proangiogenic factors were also found. A- and b-waves of scotopic ERG were reduced (p <0.05) in eyes of animals with CNV injuries as compared to nonlasered ones. Conclusions. We succeeded in reproducing and validating the CNV model in our laboratory, thus affording us the opportunity to evaluate α2M/LRP1 involvement.Funding. SeCyT-UNC 2017, FoNCyT 2015, FoNCyT 2016.Validação de um modelo de rato de neovascularização coroidal (CNV) induzida por laserIntrodução. A degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) em sua forma neovascular é uma das principais causas de perda da visão em adultos maiores de 55 anos. Neste estudo validamos um procedimento estabelecido para a indução da neovascularização coroidal (CNV, por suas siglas em inglês) em ratos. Este procedimento consiste na peroração da membrana de Bruch por meio de fotocoagulação induzida por laser, reproduzindo a forma neovascular de DMRI.Objetivo. Caracterizar o processo neovascular e seu impacto na funcionalidade da retina assim como seu perfil inflamatório. Os trabalhos prévios realizados em nosso laboratório demostraram que α2M e seu receptor (LRP1) participam durante a neovascularização da retina, pelo qual também nos centramos na participação do sistema α2M/LRP1.Métodos. A ratos C57BL/6, 3-6 meses de idade, previamente anestesiados, realizaram-se lhes quatro lesões de fotocoagulação por olho com um laser de árgon verde. Depois de 7 dias de realizadas as queimaduras por laser, analisamos as lesões de neovascularização em flatmount de coroides-EPR através de tinção com isolectina B4 utilizando microscopia confocal. Ao mesmo tempo, por meio de imunotinção de marcadores específicos se caracterizaram as diferentes populações celulares localizadas na área da lesão: CD105 (célula endotelial), NG2 (pericitos), F4/80 (microglia), tanto como a distribuição do receptor LRP1 nestas células. Adicionalmente, os níveis de proteína de α2M e LRP1 se analisaram por ensaios de WB e o perfil inflamatório, avaliado pelos níveis de IL1β, IL6 e TNFα através de ensaio de qPCR. A funcionalidade da retina se avaliou por meio de ERG escotópico.Resultados. Conseguimos estandardizar o tamanho da lesão. Observou-se uma quantidade importante de célula endotelial e pericitos ao redor da lesão. As células da microglia localizaram-se na área central e periférica da lesão, enquanto α2M e LRP1 mostraram um aumento no nível de proteína acompanhado de um grande padrão de expressão em células próximas à lesão; como também se evidenciaram altos níveis de fatores pró-inflamatórios e pró-angiogênicos. As ondas a e b de ERG escotópico se reduziram (p <0,05) nos olhos de animal com a lesão CNV respeito dos que não receberam o tratamento com laser.Conclusões. Conseguimos reproduzir e validar o modelo CNV em nosso laboratório, que nos proporciona a possibilidade de avaliar a participação do sistema α2M/LRP1.Financiamento. SeCyT-UNC 2017, FoNCyT 2015, FoNCyT 2016.