Análisis de la Actividad Catalítica de Cruzipaína mediante Estudios de Dinámica Molecular Híbrida QM/MM

CERUTTI, JUAN PABLO; ROITBERG, ADRIAN; QUEVEDO, MARIO ALFREDO

Guatemala

Simposio; Simposio Iberoamericano COIFFA 2020; 2020

Conferencia Iberoamericana de Facultades de Farmacia

Cruzipaína (CZP) es la principal cisteín proteasa de T. cruzi, el agente causal de la Enfermedad de Chagas. Su sitio activo se caracteriza por la presencia de 3 subdominios principales (S1-S3) y de una triada catalítica formada por Cys25, His162 y Asn182. Ante el interés por el desarrollo de inhibidores de CZP y especialmente en el contexto del diseño racional de potenciales fármacos, resulta esencial esclarecer detalladamente los mecanismos moleculares implicados en su actividad catalítica y potencial de inhibición. Una de las metodologías más empleadas a tal fin es la que aplica estudios de dinámica molecular híbrida clásica-cuántica, conocidos como QM/MM-MD(Quantum Mechanics/Molecular Mechanics Molecular Dynamics). Este estudio permite evaluar la coordenada de reacción catalítica de la enzima segmentando el sistema de interés en múltiples regiones, modelando cada una de ellas empleando un nivel de cálculo adecuado para describir las propiedades estructurales, electrónicas y energéticas de todo el sistema con un costo computacional moderado. Este método ha sido utilizado con éxito en la descripción detallada de diversas reacciones de relevancia en el campo de la bioorgánica. Recientemente, Moliner y colaboradores han reportado los resultados de estudios QM/MM-MD del mecanismo catalítico de CZP frente a un sustrato no específico. Sin embargo, la actividad catalítica de CZP frente a sustratos específicos, tales como el dipéptido fluorogénico comercial Z-Phe-Arg-AMC (Z-FR-AMC) que es ampliamente empleado en ensayos biológicos, no ha sido reportada hasta el momento. Asimismo, los estudios de QM/MM-MD han sido empleados para predecir los mecanismos de inhibición de algunos inhibidores irreversibles de CZP reportados, tales como halometilcetonas, dipeptidil nitroalquenos y la vinilsulfona K777 (Fig. 1B). Este último constituye uno de los inhibidores de CZP más estudiados y que ha demostrado prometedora actividad antichagásica en estudios preclínicos. Por otra parte, a pesar de que se han reportado estructuras cristalográficas homodiméricasde CZP (CZP-HD) y que se conoce que algunas cisteín proteasas relacionadas a CZP funcionan catalíticamente como dímeros (ej.: Mpro de SARS-CoV-2), todos los estudios in silico reportados al momento han sido realizados frente a la estructura monomérica de CZP (CPZ-MO), originando una descripción incompleta de las relaciones estructura actividad relacionadas con la ocupación del subsitio S1 de la enzima. Finalmente, la relevancia de la estereoquímica para los procesos catalíticos e inhibitorios de CZP hasido reportada desde el punto de vista experimental, aunque no exhaustivamente explorada a nivel molecular empleando metodologías computacionales. OBJETIVO: Modelar y comparar las coordenadas de reacción de CPZ-MO y CZP-HD, evaluando unsustrato comercial (Z-FR-AMC) y un inhibidor irreversible (K777) con diferente estereoquímica, a través de estudios QM/MM-MD. Las estructuras de CZP-MO y CZP-HD fueron extraídas de Protein Data Bank (PDB ID: 4IUT y 4PI3). Z-FR-AMC y K777 con configuraciones (S,S) y (S,R) fueron sometidos a estudios de docking molecular empleando el software DOCK6 y loscomplejos resultantes fueron estudiados mediante dinámica molecular clásica (MMMD) en condiciones de solvente explícito, empleando el paquete Amber20. Luego de realizar estimaciones de la energía libre de unión (dGMM-GBSA), las coordenadas finales de las simulaciones MM-MD se seleccionaron como punto de partida para los estudios de QM/MM-MD, analizando la coordenada de reacción catalítica de CZP aplicando la metodología de umbrella sampling. Todos los cálculos se llevaron a cabo empleando el paquete Amber20, aplicando el método semiempírico SCC-DFTB en la capa cuántica delsistema (ligando y triada catalítica) y los campos de fuerza ff14SB y TIP3P para describir la región clásica (región estructural de la proteína y solvente). Los perfiles de energía libre de reacción se obtuvieron aplicando el método de análisis de histograma ponderado implementado en vFEP (Variational free energy profile). Las simulaciones QM/MM-MD se llevaron a cabo en los sistemas de cómputo Hipergator (UFL-USA) yTupac (Argentina). RESULTADOS: La unión y la coordenada de reacción correspondientes al sustrato (S,S)-Z-FR-AMC fueron evaluadas para CZP-MO y CZP-HD. Se observó una mayor afinidad por CZP-HD que por CZP-MO, con dGMM-GBSA de -59±3 y -37±2kcal/mol, respectivamente. La interacción favorable entre el grupo guanidino (R1) del sustrato y los residuos Ser64 y Asp376 de CZP-HD es la responsable de la estabilización adicional observada. Respecto a la reacción de acilación de CZP sobre el sustrato, se pudo observar que la energía de activación del intermediario tetraédrico (tiohemiacetal) es 6 kcal/mol mayor para CZP-MO (Ea=18.5 kcal/mol) comparado con CZP-HD (Ea=12.5kcal/mol). Respecto de la estereoselectividad de CZP, cuando se evaluó el diastereómero (S,R)-Z-FR-AMC, se observaron valores de dGMM-GBSA similares a los de(S,S)-Z-FR-AMC (-52±3 y -34±2 kcal/mol, para CZP-HD y CZP-MO, respectivamente). Sin embargo, se observó que las energías de activación para la reacción de acilación de (S,R)-Z-FR-AMC son significativamente mayores que las calculadas para el diastereómero(S,S)-Z-FR-AMC (35.2 kcal/mol y 28.4 kcal/mol para CZP-MO y CZP-HD, respectivamente) Ello es consistente con la estereoselectividad de CZP observada experimentalmente.Respecto del inhibidor irreversible K777, se observó un comportamiento homólogo al del sustrato Z-FR-AMC. En tal sentido, las dGMM-GBSA calculadas para la configuración(S,S) fueron de -31±3 y -46±4 kcal/mol para CZP-MO y CZP-HD, respectivamente; observando nuevamente que la orientación del sustituyente R1 hacia el par Ser64-Asp376 de CZP-HD aporta la estabilización adicional. Al comparar las energías deactivación asociadas a la coordenada de reacción para la inhibición, se observó que lareacción es 4.4 kcal/mol más favorable para CZP-HD (Ea=12.0 kcal/mol) que para CZP-MO(Ea=16.4 kcal/mol). En los estudios de estereoselectividad empleando (S,R)-K777, sehallaron resultados homólogos a los descritos para Z-FR-AMC. En este sentido, los dGMMGBSA de (S,R)-K777 son comparables a los de (S,S)-K777 para ambos sistemas (-28±3kcal/mol y -43±3 kcal/mol para CZP-MO y CZP-HD, respectivamente), con energías deactivación para las reacciones de acilación siendo 9.2 y 9.4 kcal/mol más altas que para(S,S)-K777 (25.6 kcal/mol para CZP-MO y 21.4 kcal/mol para CZP-HD). Las energías deactivación menos favorables para el sustrato e inhibidor con configuración (S,R) puedenexplicarse en términos de factores estéricos, ya que para que las reacciones tenganlugar, los ligandos deben acercarse al residuo catalítico de CZP (Cys25). Por ende, la configuración del Cα al centro electrofílico debe ser la adecuada para que el sustituyente R1 pueda orientarse correctamente evitando el bumping con el backbone de la enzima.Los mecanismos catalíticos y de inhibición de CZP fueron evaluadosmediante estudios de docking molecular, MM-MD y QM/MM-MD. Para los 4 ligandos estudiados, se observaron valores de las dGMM-GBSA más negativos y energías de activación menores para las reacciones catalizadas por CZP-HD, lo que sugiere la potencial actividad homodimérica de CZP. Esta hipótesis es consistente con la potente actividad inhibitoria de Chagasina, inhibidor natural de CZP que bloquea la homodimerización de la enzima. Asimismo, se pudo justificar a nivel molecular la estereoselectividad catalítica de CZP, la cual se encuentra principalmente relacionada a requerimientos estéricos asociados a la coordenada de reacción. Finalmente, el protocolo desarrollado demostró excelente potencial para el diseño racional de nuevosy potentes inhibidores irreversibles de CZP.