Desarollo de PCR-ELISA para la detección de Mycobacterium bovis en leche de tambo

ANA CISLAGHI; DANA PEDROTTI

La Plata

Jornada; XXIII Jornadas de Jóvenes Investigadores de la Asociación de Universidades Grupo Montevideo; 2016

Universidad Nacional de la La Plata

El método de diagnóstico de Tuberculosis bovina más empleado para certificación oficial de rodeos es la prueba intradérmica de tuberculina (PPD), de baja sensibilidad y subjetividad en su interpretación. Surge así la necesidad de disponer de nuevas herramientas diagnósticas para la detección del Mycobacterium bovis en tanques de leche. A tal fin, la amplificación de la secuencia génica de inserción IS6110 mediante PCR ha permitido detectar, con elevada sensibilidad, presencia bacteriana en leche de tanque. Con el propósito de mejorardicha metodología modificamos la estrategia diagnóstica, aplicando la técnica ELISA para la detección de los productos amplificados. Se emplearon cebadores marcados con biotina (BIO) y digoxigenina (DIG). La BIO se une a la estreptavidina inmovilizada en la superficie de la placa y la molécula de DIG, asociada al otro extremo, es reconocida por un anticuerpo anti-DIG conjugado auna peroxidasa, la que cataliza una reacción de color,en virtud de la presencia de M. bovis. Para determinar los parámetros fisicoquímicos que permitan discriminar presencia de ausencia del M. bovis, se evaluaron diferentes ciclos de PCR así como también concentraciones de estreptavidina, amplicones y conjugado, empleando controles positivos y negativos. Se determinó que la dilución de los productos al 2% de una PCRbio de 20 ciclos era la más conveniente para realizar un ELISA, inmovilizando 0.05µg de estreptavidina/pocillo y usando 0.075 U/ml de anticuerpo conjugado.