ESTUDIO DEL MECANISMO DE ACCION CITOTOXICO DE UN TETRANORTRITERPENO AISLADO DE MELIA AZEDARACH EN CELULAS DE CARCINOMA COLORRECTAL HUMANO

MARIANA BELÉN JORAY; FLORENCIA VILLAFAÑEZ; MARÍA LAURA GONZÁLEZ; SARA MARÍA PALACIOS; MARÍA INÉS CRESPO; JOSÉ LUIS BOCCO; GASTÓN SORIA; MARÍA CECILIA CARPINELLA

Simposio; IX INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON NATURAL PRODUCTS CHEMISTRY AND APPLICATIONS; 2016

Melia azedarach es una especie naturalizada ampliamente distribuida en Argentina.Previamente en nuestro laboratorio, se aisló a partir del endocarpio de esta planta al tetranortriterpeno meliartenin. Tal como fue descripto, este compuesto existe en solución como parte de una mezcla isomérica (1) junto a su isómero interconvertible 12-hidroxiamoorastatin 1.En el presente trabajo, la toxicidad de 1 fue evaluada frente a un panel de células tumorales constituido por células de leucemia linfoblástica aguda (CCRF-CEM) y de leucemia mieloide crónica (K562) junto a sus respectivas variantes resistentes a multidroga, CEM/ADR5000 y Lucena 1; células de carcinoma de pulmón (A549) y dos líneas de carcinoma colorrectal (HCT116 y HCT4016). Por otro lado se evaluó su efecto tóxico sobre células mononucleares de sangre periférica humana. Estos ensayos fueron realizados mediante la técnica de MTT. La línea HCT116 presentó la mayor sensibilidad frente a 1 con un valor de IC50 de 0.2 μM por lo que fue seleccionada para llevar adelante los estudios de mecanismo de acción. En una primera instancia, se llevó a cabo el ensayo de supervivencia clonogénica. Éste evidenció una importante reducción de la capacidad de formación de colonias tras la exposición a diferentes dosis de tratamiento durante un período de 72 h con un valor de IC50 de 0.04 μM. Posteriormente, se realizaron diversos estudios de citometría de flujo. La inducción de muertecelular fue evaluada empleando la tinción SYTOX Red y también por doble tinción con Anexina V/SYTOX Red. Estos estudios demostraron que la muerte observada estaría principalmente asociada a un proceso de apoptosis. Por otro lado se estudió el efecto de 1 sobre la progresión del ciclo celular en la línea tumoral bajo estudio mediante tinción de ADN con Ioduro de Propidio. Las células tratadas mostraron un retraso en la progresión por la fase S del ciclo celular junto a un incremento de la población hipodiploide (Sub-G1). Estos resultados fueron confirmados mediante estudios de proliferación con análogos de timidina. En base a estos resultados se decidió evaluar la influencia de 1 en la expresión de p53 y p21, proteínas clave en la regulación de la progresión del ciclo y de la muerte celular en respuesta a agentes genotóxicos. Mediante Western Blot sepudo observar que 1 indujo la expresión de p53 y p21 en HCT116. Para determinar la relevancia de la inducción de estas proteínas en la muerte celular observada se evaluó el efecto citotóxico selectivo de 1 sobre líneas isogénicas derivadas HCT116 p53 -/- y HCT116 p21 -/-, en comparación con la línea parental HCT116. Las células HCT116 p53 -/- mostraron una marcada resistencia al tratamiento, confirmando el rol central de p53 en la inducción de muerte celularmediada por 1.En conclusión, los resultados obtenidos permiten delinear el mecanismo molecular de acción en la citotoxicidad ejercida por 1, posicionándolo como potencial candidato anti-tumoral per se o bien como líder para el desarrollo de nuevos agentes con citotoxicidad selectiva para líneas tumorales con expresión normal de p53.