INTRODUCCIÓN
El Ácido Ascórbico (AA), un activo biorregulador, es considerado una de las vitaminas hidrosolubles más importantes por sus propiedades antioxidantes. En solución acuosa es muy inestable, principalmente al ser expuesto a la luz, a valores extremos de pH, a la presencia de oxígeno y de altas temperaturas.
Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos que permiten mejorar propiedades físico-químicas y farmacéuticas tales como estabilidad química, solubilidad acuosa, velocidad de disolución, permeabilidad a través de membranas y biodisponibilidad. Se han realizado estudios sobre la aplicación simultánea de la formación de complejos de inclusión con ciclodextrinas y la formación de sales, con la finalidad de mejorar las propiedades físico-químicas de diversos fármacos como resultado del efecto sinérgico de dicha combinación [1,2].
En estudios realizados previamente en nuestro grupo de investigación, se determinó que la formación de complejos con hidroxipropil-b-ciclodextrina (HP-b-CD) y trietanolamina (TEA) incrementa la estabilidad química [3] y la fotoestabilidad del Ácido Ascórbico en solución acuosa [4].
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) es el método más conveniente e informativo para estudiar complejos de ciclodextrinas con sustratos orgánicos. La resonancia magnética nuclear de protones (1H-RMN) pone de manifiesto la formación de un complejo de inclusión entre ciclodextrinas y una molécula huésped, mediante cambios en los desplazamientos químicos (Dd) de los protones de ambas moléculas [5]. El espectro de una mezcla huésped-ligando permite determinar la orientación y la penetración de la molécula huésped en la cavidad de la ciclodextrina [6]. Debido a que el entorno de los protones en la cavidad de la ciclodextrina cambia con la asociación con la molécula huésped, pueden observarse desplazamientos hacia campos mayores en las señales correspondientes a los protones internos H3 y H5 [7]. Similarmente, pueden observarse desplazamientos en las señales correspondientes a los protones del huésped que penetran dentro de la cavidad de la ciclodextrina.
La resonancia magnética nuclear de carbonos (13C-RMN) proporciona considerable información del entorno individual de los carbonos y de las interacciones intermoleculares, por lo que es útil para el análisis del fenómeno de inclusión [5].
En este trabajo se empleó la espectroscopia RMN para obtener información acerca de la existencia de complejos de Ácido Ascórbico en solución acuosa. Se realizó el estudio de los sistemas binarios del Ácido Ascórbico con HP-b-CD y TEA, y del sistema ternario con HP-b-CD y TEA empleando la 1H-RMN. Para profundizar el estudio de la interacción del Ácido Ascórbico con HP-b-CD se empleó 13C-RMN.
METODOLOGÍA
Los experimentos de RMN fueron realizados a 200,13 MHz utilizando un espectrómetro Bruker AC 200. Los compuestos puros y sus combinaciones equimolares fueron solubilizados en D2O. Las concentraciones de los componentes en las soluciones acuosas deuteradas fueron: 11mg/mL para el Ácido Ascórbico, 76,4 mg/mL para HP-b-CD y 25 mg/mL para TEA. Todos los espectros fueron registrados inmediatamente después de la preparación de las soluciones para evitar la degradación del Ácido Ascórbico. Los desplazamientos químicos fueron medidos en relación a la señales del solvente D2O para 1H y de metanol para 13C.
RESULTADOS
Se evaluó la inclusión del Ácido Ascórbico en la cavidad de la HP-b-CD, así como su interacción con la TEA, mediante los Dd en los complejos respecto a las señales correspondientes al Ácido Ascórbico, la HP-b-CD y la TEA puros.
En las condiciones experimentales empleadas solo ocurrieron cambios en los desplazamientos de las señales, no aparecieron nuevas señales que puedan ser asignadas a los complejos. Esto sugiere que la complejación es un proceso dinámico con un rápido intercambio entre las formas libre y acomplejada.
En los espectros de 1H-RMN, de los sistemas en estudio, fueron observados apreciables Dd en las señales del Ácido Ascórbico, con respecto al espectro del compuesto puro, debidos a cambios conformacionales ocurridos como resultado de la complejación.
El espectro de 1H-RMN del sistema Ácido Ascórbico - HP-b-CD mostró Dd a campos mayores en las señales de los protones internos H3 y H5 y del protón externo H4 de la ciclodextrina, inducidos por la interacción con el ácido ascórbico; mientras que los Dd de las señales de los protones externos (H1, H2, y H6) fueron mínimos y en magnitudes similares, lo que es una fuerte evidencia de la formación de un complejo de inclusión. Los Dd de las señales de los protones ubicados en la superficie interna, pueden adjudicarse a un efecto anisotrópico producido por grupos muy ricos en electrones p [7], lo que sugiere que el anillo del Ácido Ascórbico penetra en la cavidad, ya que posee los únicos grupos con electrones p en la molécula. La magnitud del Dd del protón H3 (0,042) es mucho mayor que la del protón H5 (0,010), lo que permite hipotetizar que el Ácido Ascórbico interacciona con los hidroxilos secundarios localizados en el extremo ancho de la cavidad de la ciclodextrina [8]. Además, el protón H6, localizado en el borde del extremo angosto de la cavidad, no es afectado significativamente (Dd= 0,005) por la presencia de la molécula huésped. No obstante, el Dd del protón externo H4 (Dd= 0,008) hacia campos mayores indica la existencia de una probable interacción entre el Ácido Ascórbico y la superficie externa de la ciclodextrina [8]. Los Dd de todas las señales de la ciclodextrina hacia campos mayores, sugieren que predomina una interacción hidrofóbica entre el Ácido Ascórbico y la ciclodextrina.
Los Dd en las señales de los protones de la molécula huésped, hacia campos mayores, indican que dichos protones se encuentran en la proximidad de átomos de la ciclodextrina ricos en electrones p, es decir que están asociados a átomos de oxígeno [7]. Por lo tanto, los Dd de los protones del Ácido Ascórbico permiten sugerir que su cadena alifática no penetra a la cavidad de la ciclodextrina.
El espectro de 13C-RMN muestra un marcado Dd de las señales del Ácido Ascórbico en presencia de HP-b-CD. Las señales de los carbonos de la cadena alifática lateral se desplazan hacia campos menores, mientras que las señales del resto de los carbonos lo hacen hacia campos mayores. Estos Dd son consistentes con la introducción del anillo de la molécula de Ácido Ascórbico dentro de la cavidad de la ciclodextrina, y nos permiten sugerir que en el proceso de complejación está involucrado el anillo lactona y preferentemente la parte del C4 del compuesto.
En el espectro de 1H-RMN del sistema Ácido Ascórbico ? TEA se observaron marcados cambios en los Dd de ambas moléculas, que demuestran una fuerte interacción entre la TEA y el Ácido Ascórbico. Estos resultados nos permiten asumir la formación de un complejo de asociación, como resultado de la formación de un enlace de hidrógeno entre el nitrógeno electronegativo del aminoalcohol y el hidrógeno enólico del Ácido Ascórbico.
El espectro de 1H-RMN del sistema ternario Ácido Ascórbico - HP-b-CD - TEA presentó una considerable complejidad. Se observaron Dd de las señales de los protones del Ácido Ascórbico, de TEA y del protón externo H4 de la ciclodextrina, mientras que las señales de los protones internos H3 y H5 de la ciclodextrina no se ven significativamente alteradas. En base a la magnitud de dichos Dd, es posible postular que el Ácido Ascórbico no forma un complejo de inclusión con la HP-b-CD en estas condiciones; sino que forma un complejo de asociación con la TEA, el cual interacciona con los grupos hidroxilos de la ciclodextrina para formar un complejo ternario.
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio demuestran que los ligandos HP-b-CD y TEA son capaces de interactuar con el Ácido Ascórbico, dando origen a complejos binarios y ternarios en solución acuosa.
La espectroscopia 1H-RMN proporcionó información significativa concerniente a las especies involucradas en la interacción de las moléculas huésped y ligando.
Tanto los resultados obtenidos por 1H-RMN como por 13C-RMN muestran claramente que la molécula de Ácido Ascórbico penetra parcialmente por el extremo ancho a la cavidad de la HP-b-CD formando un complejo de inclusión. La parte hidrofóbica de la molécula, es decir el anillo, interactúa con la cavidad de la ciclodextrina penetrando parcialmente en ella, pero la parte más polar de la molécula permanece fuera de la cavidad.
En tanto que con la TEA se forma un complejo de asociación. A su vez, dicho complejo binario en presencia de HP-b-CD interacciona con hidroxilos externos de la molécula formando un complejo ternario.
REFERENCIAS
[1] E. Redenti, L. Szente, J. Szejtli (2001) Ciclodextrin complexes of salts of acidic drugs: thermodynamic properties, structural features, and pharmaceutical applications. J. Pharm. Sci. 90, 979-986.
[2] G. Granero, C. Garnero, M. Longhi (2003) The effect of pH and triethanolamine on sulfisoxazole complexation with hydroxypropyl-b-cyclodextrin. Eur. J. Pharm. Sci. 20, 285-293.
[3] Claudia Garnero y Marcela Longhi. Estudio del incremento de la estabilidad del ácido ascórbico mediante la formación de complejos y su aplicación en el análisis de medicamentos. X Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial, 5 al 9 de Septiembre 2005.
[4] Natalia Bosque, Claudia Garnero, Munir Sabas y Marcela Longhi. Estudio de la formación de complejos sobre la fotoestabilidad del ácido ascórbico. III Congreso Argentino de Química Analítica, Noviembre de 2005.
[5] G.D. Pascal Le Corre, F. Chevanne, R. Le Verge (1996) Inclusion complexation of amide-typed local anesthetics with b-cyclodextrin and its derivatives. I. Physicochemical characterization. Int. J. Pharm. 131, 219-228.
[6] S. Anguiano Igea, F.J. Otero Espinar, J.L. Vila Jato, J. Blanco Mendez (1997) Interaction of clorfibrate with cyclodextrin in solution: phase solubility, 1H NMR and molecular modelling studies. Eur. J. Pharm. Sci. 5, 215-221.
[7] A. Ganza Gonzalez, J.L. Vila Jato, S. Anguiano Igea, F.J. Otero Espinar, J. Blanco Mendez (1994) A proton nuclear magnetic resonance study of the inclusión complex of naproxen with b-cyclodextrin. Int. J. Pharm. 106, 179-185.
[8] C.A. Ventura, S. Tirendi, G. Puglisi, E. Bousquet, L. Panza (1997) Improvement of water solubility and dissolution rate of ursodeoxycholic acid and chenodeoxycholic acid by complexation with natural and modified b-cyclodextrin. Int. J. Pharm. 149, 1-13.
