Fusarium verticillioides is one of the most common pathogens associated with corn. Currently, the inductionof systemic acquired resistance(RSA) could be a strategy to minimize lossescaused to infections in cultures. Salicylic acid (SA) induces RSA by a processcalled sensitization or "priming".In this work, the responses ofmaize plants in which RSA was induced against experimental infections with F.verticillioides were studied, and the modulatory effects of maize priming withAS were analyzed on the biochemical defense pathways mediated by SA andjasmonic acid (JA).The maize hybrids P3115 (HS) and P1780Y (HR) are considered susceptibleandresistantto infection by F. verticillioides. Seed sensitization (overnight incubation)with 1 µM AS solution was performed for both hybrids. Subsequently the seedswere transferred to pots, infected and harvested at 5, 7, 17 and 46 days postsowing (dps). Phytohormone levels were determined in both hybrids, in aerialpart and root.The results suggest that the hormonal responses to priming andinfection are differential in HS and HR. On the other hand, the priming effectwould be more effective in the HR.
Palabras clave:Fitohormonas. Resistencia sistémica. Ácido salicílico.
Phytohormones.Systemic acquired resistance. Salicylic acid.
Introducción
Unagran cantidad de hongos pueden atacar e invadir mazorcas y granos de maíz endesarrollo, causando numerosas enfermedades clasificadas como pudriciones de lamazorca. Muchos producen micotoxinas, que pueden afectar la calidad ycomerciabilidad de los granos. Uno de los patógenos de mayor relevancia es F. verticillioides, debido a las numerosas pérdidaseconómicas que puede ocasionar y la capacidad que posee este microorganismopara genera micotoxinas.
El maíz, aligual que el resto de las plantas, interactúa constantemente con patógenos(virus, bacterias, hongos) y plagas (insectos herbívoros, nemátodos) por lo queha desarrolladomecanismos que le permiten defenderse de éstos mediante uncomplejo sistema que incluye múltiples niveles de protección. Esta protecciónpuede ser física o química y constitutiva o inducida.
La resistenciainducida está relacionada con el aumento en la expresión de los genesrelacionados con la defensa. Este proceso está regulado por moléculas deseñalización como el Etileno (ET), el ácido salicílico (AS) y el ácidojasmónico (AJ). Generalmente, el AS es requerido para la resistencia apatógenos biotrofos y hemibiotrofos, mientras que el AJ y el ET median laresistencia a patógenos necrotróficos y a la mayoría de insectos herbívoros. Lamayor parte de dicha comunicación consiste en represión mutua entre el AS y elAJ; sin embargo, algunos genes pueden ser inducidos similarmente por los dosácidos.
La resistenciapuede ser estimulada o inducida por un proceso denominado sensibilización o priming, que induce una respuesta inmuneadaptativa y conduce a una defensa más rápida y más fuerte ante la infecciónpor herbívoros o patógenos. Se han identificado muchos compuestos naturales ysintéticos para estimular la resistencia de las plantas, incluidas lasfitohormonas AS, AJ y ácido abscísico (ABA) (Aranega-Bou y col, 2014)
El proceso de priming tiene lugar desde laestimulación inicial hasta la exposición a un estrés desafiante. Incluye todoslos cambios que ocurren en la planta después de la percepción de un estímulo yprepara a la planta para una mayor capacidad de respuesta cuando ocurre undesafío. Estos cambios pueden tener lugar a nivel fisiológico, molecular yepigenético; pueden ocurrir segundos u horas después de la estimulación, puedenser transitorios o mantenerse a lo largo de la vida de una planta, e inclusopueden ser heredados por generaciones posteriores. Diferentes estímulos puedencausar cambios similares, así como específicos.
El proceso desensibilización en plantas permite no solamente comprender de mejor manera losmecanismos de defensa en plantas, sino también inferir sobre potencialesmoléculas que podrían funcionar como compuestos exógenos que puedan aplicarse paracombatir enfermedades y que resulten amigables con el medioambiente.
La prohibiciónde la mayoría de los fungicidas químicos por parte de la UE (Directiva91/414/CEE) debido a los efectos adversos de su uso en el medio ambiente y lasalud humana, su toxicidad, o porque los patógenos se han vuelto resistentes asus sustancias activas, ha promovido la investigación en el campo de losinductores de resistencia vegetal como alternativa eficaz y sostenible.
Materiales y métodos
Seacondicionaron las semillas de los híbridos P3115 y P1780H (DuPont Pioneer), caracterizadoscomo híbrido susceptible (HS) y resistente(HR) a la infección por F.verticillioides, respectivamente. Posteriormente se realizó el priming de semilla con una solución deAS 1 (µM). Para esto las semillas se dejaron overnight en la solución deAS o en agua para los controles. Luego de una pre- germinación en placa, lassemillas fueron pasadas a macetas de 24 cm de diámetro, y fueron sembradas entierra a 2-3 cm de profundidad . Posteriormente se realizó una infección enhoja con una suspensión de conidias de la cepa de F. verticillioides 2024 de turbidez 0,1 DO determinada enespectrofotómetro a 600 nm. Las plantas se cosecharon a los 5, 7, 17 y 46 díaspost siembra (dps). Las macetas se colocaron en el invernadero del InstitutoMultidisciplinario de Biología Vegetal (IMBIV, CONICET-UNC), y se mantuvieronbajo condiciones controladas tanto hídricas como de temperatura y ciclos deluz/oscuridad de 14/10 horas durante todo el período experimental.
Se cuantificaronlos niveles de AS, AJ, en la porción aérea y las raíces de las plantas. Laextracción se realizó pesando 50-100 mg de tejido previamente pulverizado con N2líquido, posteriormente se homogeneizó con 500 μL de 1-propanol/H2O/HCl(2:1:0,002; v/v/v) y se agitó durante 30 minutos a 4 °C. Luego se aplicó 1 mLde diclorometano (CH2Cl2), se agitó por 30 min a 4 °C yse centrifugó a 13.000 g por 5 min. La fase orgánica se evaporó y el extracto sere suspendió con 0,25 mL de metanol al 50 % con CH2O2 al0,1 % y agua al 50 % con CH2O2 al 0,1 %. Para la detección se utilizó el equipoUPLC-MS Waters Xevo TQs Micro (Waters, Milford, MA, EE. UU.) y una columna defase reversa (C18 Waters BEH 1,7 µm, 2,1 x 50 mm, Waters). Se utilizó comosistema solvente móvil compuesto por agua con 0,1% CH 2 O 2 (A) y MeOH con 0,1%CH2O2 (B). Para fines de identificación y cuantificación se utilizó unespectrómetro de masas Xevo TQ-S micro de Waters (Milford, MA, USA) acoplado almencionado UPLC (LC-MS/MS). La relación masa/carga (m/z) para cada metabolitofue: AS: 137,0>93,0 y 137,0>65,0; AJ 209,1>165.1 y 209.1>59. Lacuantificación de las hormonas se realizó siguiendo las curvas de calibracióncon el ajuste lineal, obteniendo los resultados en nanogramo defitohormona/miligramo de tejido (peso fresco).
Resultados
Lasconsecuencias de la sensibilización y de la infección fúngica sobre lascinéticas deproducción de las fitohormonas fueron diferentes en los doshíbridos de maíz analizados.
En el HR el priming incrementó los niveles AS en lasraíces de las plántulas a los 5 dps, pero en las partes aéreas no hubodiferencias con respecto al control. Los efectos de la infección fueron másevidentes en las partes aéreas, donde se produjo un aumento transitorio de AS,disminuyendo a los 46 dps en forma significativa con respecto al control. Sinembargo, este cambio producido por la infección fue prevenido por el priming. En el HS la sensibilizaciónaumentó los niveles de AS a los 5 dps tanto en partes aéreas como raíces, yfueron disminuyendo hasta niveles comparables a los controles a partir de los17 dps (Figura 1).
Lasconcentraciones de AS en las partes aéreas y raíces de las plantas infectadas(I y ASI)fueron similares a las de sus respectivos controles (C y AS,respectivamente), y desde los 17dps en adelante no hubo diferencias entre losgrupos.
Figura 1:Efectos del priming sobre losdesbalances de AS causadas por la infeccion del maíz con F. verticillioides.
Se muestran losPromedios ± SEM de las concentraciones de AS en partes aéreas y raíces de lasplántulas de ambos híbridos (HR y HS), en los grupos control, infectado con elhongo (I), sensibilizado (AS), y sensibilizado e infectado (AS I), a los 5, 7,17 y 46 dps. Las líneas de puntos verticales marcan el día (6 dps) en el que serealizaron las infecciones (grupos I y AS I). (n=6)
En términosgenerales los efectos del priming sobre la producción de AJ en el HRfueron opuestos en las partes aéreas y raíces, disminuyéndola eincrementándola, respectivamente. La infección redujo los niveles de AJ en laparte aérea, pero a los 46 dps las concentraciones en las plantassensibilizadas e infectadas se aproximaron a las del grupo control. Si bien lasconsecuencias de la infección fueron menos marcadas en las raíces, en lasplantas sensibilizadas e infectadas los niveles de AJ aumentaron con el pasodel tiempo, y a los 46 dps superaron a los encontrados en los controles (Figura2).
En el HS, tantoel priming como la infección tuvieron pocos efectos sobre la cinética deproducción de AJ en partes aéreas en todo el período estudiado, y en raíceshasta los 17 dps. Pero a los 46 dps, la infección de plantas sensibilizadasaumentó el AJ a concentraciones superiores a las de los controles.
Figura 2:Efectos del primingsobre losdesbalances de AJ causadas por la infeccion del maíz con F. verticillioides.
Se muestran losPromedios ± SEM de las concentraciones de AJ en partes aéreas y raíces de lasplántulas de ambos híbridos (HR y HS), en los grupos control, infectado con elhongo (I), sensibilizado (AS), y sensibilizado e infectado (AS I), a los 5, 7,17 y 46 dps. Las líneas de puntos verticales marcan el día (6 dps) en el que serealizaron las infecciones (grupos I y AS I). (n=6)
Conclusiones
· Eltratamiento con AS causó alteraciones de fitohormonas con respecto a lasplantas control.
· Lasrespuestas hormonales frente al priming ya la infección son diferenciales en el HS y en el HR.
· Enel HR, el efecto de priming resultaríamás efectivo que en el HS.
Bibliografia
· Arias SL, MaryVS, Otaiza SN, Wunderlin DA, Rubinstein HR, and Theumer MG. 2016. Toxindistribution and sphingoid base imbalances in Fusarium verticillioides-infectedand fumonisin B1-watered maize seedlings. Phytochemistry 125: 54-64.
· Arias SL,Theumer MG, Mary VS, and Rubinstein HR. 2012. Fumonisins: probable role aseffectors in the complex interaction of susceptible and resistant maize hybridsand Fusarium verticillioides. J. Agric. Food. Chem. 60: 5667-5675
· Berens ML, BerryHM, Mine A, Argueso CT, Tsuda K. 2017. Evolution of Hormone Signaling Networksin Plant Defense. AnnuRev Phytopathol. 55:401-425.
· DurgbanshiA, Arbona V, Pozo O, Miersch O, Sancho JV, and Gomez-Cadenas A. 2005. Simultaneous determination of multiple phytohormonesin plant extracts by liquid chromatography-electrospray tandem massspectrometry. J.Agric. Food. Chem. 53: 8437-8442.
· Lanubile A,Pasini L, and Marocco A. 2010. Differential gene expression in kernels andsilks of maize lines with contrasting levels of ear rot resistance afterFusarium verticillioides infection. J. Plant Physiol. 167: 1398-1406.
· OtaizaGonzález SN. 2017. Bases bioquímicas de la muerte celular inducida porfumonisina B1 en plantas. Tesis de Doctorado en Ciencias Químicas. Facultad deCiencias Químicas. UNC.
· Pan X, Welti R,and Wang X. 2008. Simultaneous quantification of major phytohormones andrelated compounds in crude plant extracts by liquid chromatography-electrospraytandem mass spectrometry. Phytochemistry 69: 1773-1781.
· Robert-SeilaniantzA, Grant M, and Jones JD. 2011. Hormone crosstalk in plant disease and defense:more than just jasmonate-salicylate antagonism. Annual Review of Phytopathology49, 317-343.
· Vargas WA,Martin JM, Rech GE, Rivera LP, Benito EP, Diaz-Minguez JM, Thon MR, and SuknoSA. 2012. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic andnecrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiol158: 1342-1358.
Apoyo financiero
Este estudio fuefinanciado por SECyT-UNC (33620180101257CB y 34020190100081CB); ANPCyT (PICT-2020-SERIEA-03880,PICT-2021-CAT-I-00192, yPICT 2019-04329); y MINCyT-Cba (GRFT2019). PAV esbecaria de CONICET. VSM y MGTson investigadores de carrera (CIC-CONICET).
